Новые биосенсоры подсвечивают редактирование генов CRISPR

Обнаружить активность инструментов редактирования генов CRISPR в организмах теперь можно невооруженным глазом с помощью ультрафиолетового фонарика. Технологию разработали в Национальной лаборатории Ок-Ридж Министерства энергетики США.

Ученые продемонстрировали эти инструменты детекции в реальном времени на растениях и ожидают их применения для животных, бактерий и грибов. Возможные области использования — биотехнологии, биобезопасность, биоэнергетика и сельское хозяйство. Описание УФ-системы опубликовано в Horticulture Research, а доказательство принципа работы — в ACS Synthetic Biology.

CRISPR-технологии быстро стали основными инструментами биоинженерии, и постоянно разрабатываются их новые версии. Ранее определение того, был ли организм модифицирован с помощью CRISPR, было сложным и длительным процессом.

"До этого единственным способом определить, произошло ли редактирование генома, был судебно-медицинский анализ", — сказал Пол Абрахам, биоаналитический химик. "Для успеха нужно было знать, как выглядел геном до изменений. Мы хотели создать платформу, где могли бы проактивно наблюдать за активностью CRISPR".

Исследователи разработали эффективное решение для самодетекции, которое использует принцип работы CRISPR, чтобы заставить технологию раскрыть себя. В обычных условиях CRISPR связывается с короткой последовательностью РНК, известной как направляющая РНК (guide RNA), которая ведет CRISPR к соответствующей последовательности ДНК. Когда целевая ДНК найдена, CRISPR модифицирует её, действуя как молекулярные ножницы, разрезая одну или обе цепи ДНК в зависимости от типа используемой CRISPR-системы.

Метод команды похож на систему сигнализации с двумя компонентами:

1. Биосенсорная направляющая РНК, которая перенаправляет активность CRISPR.
2. Репортерный белок, который сигнализирует об этой активности.

Исследователи встраивают оба компонента в ДНК организма, чтобы включить систему мониторинга.

Когда система самодетекции установлена, биосенсорная РНК перехватывает CRISPR. Это мешает CRISPR связаться с первоначальной генной мишенью и перенаправляет его на специфическую последовательность ДНК, которая кодирует нефункциональный зеленый флуоресцентный белок (GFP). Когда CRISPR редактирует эту последовательность, он "включает переключатель", и начинает производиться функциональный GFP, создавая зеленое свечение — сигнал присутствия CRISPR.

Поскольку для наблюдения свечения GFP требуется микроскоп, исследователи усовершенствовали метод, заменив GFP на похожий репортерный белок eYGFPuv, который виден под ультрафиолетовым светом (так называемой "черной лампой").

"Теперь мы можем видеть, активен ли CRISPR, в реальном времени, независимо от размера, формы и местоположения оцениваемых организмов", — сказал Абрахам. "Эта гибкость ускоряет процесс биоинженерии и расширяет использование биосенсоров в лабораторных и полевых условиях".

Поскольку CRISPR необходимо адаптировать для каждого организма, знание о том, работает ли технология в конкретном растении или микробе, может ускорить прогресс в достижении целей, таких как:

• Разработка засухоустойчивых культур для биоэнергетики.
• Инженерия бактерий для эффективного преобразования растений в устойчивое авиационное топливо.

"Эти инструменты позволяют нам быстро идентифицировать положительные трансформанты с желаемыми генетическими изменениями", — сказала Кэрри Эккерт, руководитель Группы синтетической биологии ORNL. "Мы легко можем увидеть варианты, где модификация произошла, в отличие от тех, где её не было".

Биосенсоры также предоставляют эффективный метод, чтобы узнать, остается ли CRISPR активным после того, как желаемые модификации вступили в силу. Синтетический биолог растений ORNL и соавтор Сяохань Ян сравнивает активность CRISPR по редактированию генома с полезной операцией, но предупреждает, что "вы не хотите, чтобы хирург оставил ножницы внутри", поскольку продолжение активности CRISPR может иметь непреднамеренные последствия.

Ян видит применение биосенсоров, например, для проверки потомства модифицированных растений, чтобы убедиться, что механизм редактирования генов не передался им. С помощью этой технологии можно обследовать целое поле сельскохозяйственных культур.

Исследовательская группа создала специфические биосенсоры для обнаружения различных CRISPR-инструментов, включая нуклеазу Cas9, прайм-редактор (prime editor), базовый редактор (base editor) и CRISPRa. Они продемонстрировали работу сенсоров по отдельности, где каждый сигнализировал о присутствии определенного типа CRISPR-инструмента. Абрахам также видит потенциал в объединении биосенсоров в версию, которая будет обнаруживать несколько технологий редактирования генов одновременно.

"Мы продолжим оптимизировать эти биосенсоры, чтобы повысить безопасность биотехнологий следующего поколения", — сказал Абрахам.