Диагностика патогенного грибка C. auris с помощью CRISPR-отпечатка
Инфекция, вызываемая патогенным дрожжевым грибком Candida auris (C. auris), представляет серьёзную угрозу для пациентов больниц и домов престарелых, особенно для тех, чьё здоровье уже ослаблено другими заболеваниями. Патоген легко распространяется, колонизирует поверхности и может выживать на них недели и месяцы, часто проявляя устойчивость к стандартным дезинфицирующим средствам.
Особую опасность C. auris представляет для пациентов с ослабленным иммунитетом (например, после трансплантации органов, химиотерапии или при ВИЧ), а также для пациентов с высоким риском инфицирования (использующих инвазивные устройства: дыхательные или питательные трубки, катетеры).
Попадание C. auris в кровоток или жизненно важные органы становится опасным для жизни. Хотя инфекции в принципе можно лечить несколькими противогрибковыми препаратами, быстрое появление штаммов с устойчивостью к этим лекарствам (antimicrobial resistance, AMR) стало серьёзной проблемой. Это приводит к необходимости смены терапии или, в худшем случае, к отсутствию эффективного лечения.
"Клиницистам нужен гораздо более эффективный диагностический подход, чтобы точно определять количество патогена у пациентов и оценивать его устойчивость к противогрибковым препаратам", — заявил Джастин Роландо, доктор философии, первый автор нового исследования.
Новое исследование предлагает решение — подход прецизионной диагностики, который впервые позволяет быстро и точно определять количество штаммов C. auris в мазках, а также выявлять мутации, вызывающие AMR, в смешанных популяциях грибка. Результаты опубликованы в Nature Biomedical Engineering.
Новая технология dSHERLOCK
Тест нового поколения основан на интеграции двух технологий:
- SHERLOCK — CRISPR-метод диагностики от группы Джеймса Коллинза, позволяющий с однонуклеотидной точностью обнаруживать нуклеиновые последовательности патогенов.
- Ультрачувствительная одномолекулярная микрочиповая технология из группы Дэвида Уолта.
Мониторинг развития тысяч параллельных флуоресцентных сигналов в реальном времени и их анализ с помощью машинного обучения позволили создать быстрый количественный метод — dSHERLOCK (digital SHERLOCK). Он измеряет степень колонизации C. auris и выявляет мутации, вызывающие специфическую устойчивость к противогрибковым препаратам.
Ключевые достижения метода
- Быстрота: Обнаружение C. auris в мазках — за 20 минут, точное количественное определение — в течение 40 минут. Для сравнения: текущая клиническая практика (отправка образцов в центральные лаборатории) может занимать до недели.
- Количественный анализ и определение AMR: Настроив CRISPR-механизм детекции, исследователи научились усиливать мишени C. auris, содержащие мутации AMR. Флуоресцентные сигналы от разных мишеней генерируются с разной скоростью ("кинетикой"), что создаёт уникальные "сигнатуры" для конкретных мутаций устойчивости к часто используемым азолам и эхинокандинам.
- Простота: Условия реакции были оптимизированы до формата "one-pot-reaction", которая протекает автономно от начала до конца.
- Анализ данных: Для обработки сложных флуоресцентных данных (~18 000 индивидуальных ячеек на микрочипе) была разработана вычислительная платформа с алгоритмом машинного обучения. Он декодирует сигналы и определяет наличие и количество как патогена, так и штаммов с AMR.
"Возможности dSHERLOCK удовлетворяют основным клиническим требованиям к анализу следующего поколения для быстрой идентификации и количественной оценки нагрузки C. auris... и получения количественного снимка ландшафта AMR в отдельных образцах", — сказал соавтор-руководитель Джеймс Коллинз.
Другой старший автор, Дэвид Уолт, подчеркнул более широкий потенциал платформы: "dSHERLOCK... можно относительно легко адаптировать для обнаружения, количественного определения и характеристики множества других патогенов, представляющих серьёзные проблемы для здоровья".