Новый инструмент на основе CRISPR вставляет большие последовательности ДНК в нужные участки клеток

Исследователи MIT разработали новый инструмент на основе системы редактирования генов CRISPR, который может вырезать дефектные гены и заменять их новыми более безопасным и эффективным способом.

С помощью этой системы, названной PASTE (Programmable Addition via Site-specific Targeting Elements), исследователи показали, что могут доставлять гены длиной до 36 000 пар оснований ДНК в несколько типов человеческих клеток, а также в клетки печени мышей. Эта методика может быть перспективна для лечения заболеваний, вызванных дефектными генами с большим количеством мутаций, таких как кистозный фиброз.

Принцип работы PASTE

Новый инструмент сочетает точное нацеливание системы CRISPR-Cas9 с ферментами, называемыми интегразы, которые вирусы-бактериофаги используют для встраивания своего генетического материала в геном бактерий.

  • Задача: Избежать двухцепочечных разрывов ДНК, которые могут вызывать хромосомные делеции или перестройки, вредные для клеток.
  • Решение: Использование сериновых интеграз, способных вставлять очень крупные фрагменты ДНК (до 50 000 пар оснований) в специфические последовательности-«посадочные площадки» (attachment sites) в геноме.

PASTE работает в два этапа:

  1. Система на основе CRISPR-Cas9 и обратной транскриптазы вставляет короткую «посадочную площадку» (46 пар оснований) в строго заданный участок генома без создания двухцепочечных разрывов.
  2. Интеграза распознает эту площадку и встраивает в неё свой крупный полезный груз — новый ген.

Результаты исследования

  • В клетках человека: Ученые успешно вставили гены в клетки печени, T-клетки и лимфобласты. Было протестировано 13 различных генов-грузов, встраиваемых в 9 разных участков генома.
  • Эффективность: Частота успешной вставки варьировалась от 5% до 60%. Метод давал очень мало нежелательных инделей (вставок или делеций) в сайтах интеграции.
  • In vivo: В «гуманизированной» печени мышей (состоящей на ~70% из человеческих гепатоцитов) PASTE успешно интегрировал новые гены примерно в 2,5% этих клеток.

Перспективы применения

Методика может быть полезна для лечения:

  • Кислотного фиброза (замена дефектного гена)
  • Заболеваний крови (гемофилия, дефицит G6PD)
  • Болезни Хантингтона (вызванной геном с избыточными повторами)

Исследователи выложили свои генетические конструкции в открытый доступ для научного сообщества.

2022-11-24