Редактирование митохондрий с помощью CRISPR: перспективная новая биотехнология?
Применение системы CRISPR/Cas9 для редактирования ядерного генома широко распространено, однако её использование для редактирования митохондриального генома (мтДНК) сталкивается с проблемами. Основные препятствия — отсутствие подходящих сайтов для редактирования в небольшой мтДНК и традиционная сложность доставки направляющей РНК (gRNA) в митохондриальный матрикс для доступа к нуклеоидам.
Две недавние публикации указывают на прогресс в решении этих задач.
CRISPR-подход и его ограничения
В статье в журнале SCIENCE CHINA Life Sciences CRISPR-методы использовали для индукции событий вставки/делеции (InDel) в нескольких микрогомологичных регионах мтДНК. Эти события запускались двухцепочечными разрывами (DSB). Эффективность мутагенеза InDel значительно повышалась при использовании мультиплексирования sgRNA и ингибитора репарации DSB — инипариба, что указывает на возможность перенастройки механизмов репарации для манипулирования мтДНК.
Однако эксперт по редактированию митохондрий Пайам Гэммидж указывает на три ключевые проблемы этого подхода:
- Проблема доставки sgRNA в митохондрии в статье решена не полностью.
- Cas9-белок в высоких концентрациях без gRNA может вызывать неспецифические двухцепочечные разрывы.
- Ингибитор репарации (инипариб), возможно, действует не так, как считалось (он не ингибирует митохондриальную PARP).
Альтернатива CRISPR: редакторы оснований
Новый точный подход, не требующий CRISPR, разработал Дэвид Лю из Broad Institute. Его метод использует бактериальный токсин DddA, катализирующий дезаминирование цитозинов в двухцепочечной ДНК. Добавление ингибитора урацил-гликозилазы и TALEN-подобных белков позволило создать DddA-производные редакторы цитозиновых оснований (DdCBEs), не содержащие РНК. Они катализируют преобразование C•G в T•A в мтДНК человека с высокой специфичностью.
Группа Лю успешно отредактировала пять митохондриальных генов: MT-ND1, MT-ND2, MT-ND4, MT-ND5 и MT-ATP8. Плазмиды с этой технологией доступны в Addgene (например, конструкция ND4-DdCBE-right side TALE на основе pCMV). Однако метод применим только для конкретных типов преобразований оснований.
Потенциал и этические вопросы
Технология редактирования мтДНК открывает возможности для создания полезной гетероплазмии — например, митохондрий, лучше адаптированных к высокогорью или с усиленным термогенезом. Однако такие соматические изменения вряд ли будут наследоваться, так как не попадут в половые клетки. Искусственное изменение митохондрий в яйцеклетке остаётся крайне рискованной областью.
Интересный природный пример — гаттерия (туатара), у которой обнаружены две независимые линии митохондрий с расхождением последовательностей около 10%. Исследователи предполагают, что это может давать адаптивное преимущество.
Медицинское значение
Редактирование митохондрий востребовано для лечения неврологических и редких заболеваний. Например, с аутизмом ассоциирована мутация G8363A в транспортной РНК(Lys). Другие исследования показали, что митохондриальная недостаточность из-за миссенс-мутации в гене ND6 (ND6P25L) вызывает у мышей фенотипы, сходные с аутизмом. Редактирование митохондрий на животных моделях может помочь в изучении и лечении заболеваний с митохондриальным компонентом.