Высокоэффективная техника редактирования генов CRISPR для культивируемых устриц

Устрицы, как представители двустворчатых моллюсков, широко распространены и являются основой крупной аквакультуры и рыболовства во всем мире. Однако устрицы все еще находятся на ранней стадии одомашнивания.

Исследовательская группа под руководством профессора Чжан Линьлинь из Института океанологии Китайской академии наук предложила высокоэффективную технику редактирования генов CRISPR для культивируемых устриц. Это мощный инструмент для селекции с помощью генной инженерии с целью улучшения продуктивных признаков у устриц и других видов аквакультуры.

Результаты были опубликованы в Frontiers in Marine Science 26 мая.

Исследователи провели CRISPR-опосредованный нокаут гена методом электропорации у Crassostrea gigas angulate, используя ген β-тубулина в качестве маркера. Они обнаружили делеции (выпадения) длинных фрагментов в целевом гене и наблюдали мозаичные мутации, включая дефектные реснички и снижение подвижности у личинок первого поколения.

Предыдущая стратегия в основном генерировала небольшие делеции/вставки (indels), производимые одиночными разрезами sgRNA, что обычно требует много времени при генотипировании. Стратегия, использованная в этом исследовании, включала совместную инъекцию более двух направляющих РНК (sgRNAs) с целью создания делеций длинных фрагментов. Это значительно повысило эффективность редактирования и упростило процесс генотипирования мутантов с помощью обычного агарозного геля. В исследовании была обнаружена делеция длинного фрагмента более 300 п.н. в целевом гене.

Мозаицизм, возникающий в результате редактирования генома CRISPR/Cas9 в модельных животных, представляет ценность. Команда создала мозаичный мутагенез с нелетальными, но легко наблюдаемыми фенотипическими эффектами. Нокаут β-тубулина опосредовал мозаичные паттерны экспрессии Cgβ-тубулина, и мозаичные дефекты ресничек наблюдались в области перитроха, кишечных ресничек и заднего ресничного кольца у личинок C. gigas angulate.

"Применение технологий редактирования генома у устриц требует создания эффективного инструмента мутагенеза CRISPR/Cas9, способного генерировать значительные дефектные фенотипы", — сказал первый автор исследования доктор Чан Цзюлинь.

Исследователи провели CRISPR/Cas9-опосредованный нокаут гена методом электропорации и наблюдали делеции длинных фрагментов и мозаичные мутации у личинок первого поколения культивируемой устрицы. Предложенная стратегия повышает эффективность мутагенеза, упрощает рабочий процесс редактирования генома и предоставляет новый инструмент в экспериментальной системе моллюсков для изучения функции генов.

"Применение технологии редактирования генов CRISPR/Cas9 у морских моллюсков все еще сталкивается с проблемами, как в функциональной геномике, так и в селекции с помощью генной инженерии. Это исследование может послужить полезным ориентиром для широкого применения технологии редактирования генов у моллюсков в будущем", — сказал профессор Чжан.