Модификация структуры направляющей РНК CRISPR предотвращает иммунный ответ в клетках-мишенях

CRISPR/Cas9-опосредованное редактирование генома стало мощным инструментом для моделирования заболеваний и разрабатывается для клинического применения. Предварительно собранные рибонуклеопротеины (RNP) Cas9, состоящие из рекомбинантного белка Cas9 и направляющих РНК (gRNA), синтезированных in vitro (IVT), можно доставлять в клетки без риска интеграции чужеродной ДНК в геном хозяина и с меньшим количеством нецелевых эффектов. Однако, как показало исследование, опубликованное в Genome Research, gRNA, полученные in vitro и содержащие 5'-трифосфатную группу (5'ppp), активируют иммунный ответ в клетках человека, приводя к их гибели.

В этом исследовании ученые сгенерировали IVT gRNA, комплексировали их с очищенным Cas9 и трансфицировали в клетки рака шейки матки человека (HeLa) и мышиные эмбриональные фибробласты. В этих клетках gRNA с 5'ppp вызывали иммунный ответ, опосредованный интерфероном I типа, а также повышали экспрессию противовирусных эффекторных белков, таких как DDX58, что приводило к гибели клеток.

Исследование также демонстрирует цитотоксическое действие 5'ppp gRNA на Т-клетки человека. Поверхностный рецептор Т-клеток CCR5 участвует во входе вируса ВИЧ и является перспективной мишенью для терапии. Ученые показали, что предварительная обработка IVT gRNA фосфатазой удаляет 5'ppp и значительно снижает иммунный ответ и цитотоксичность в Т-клетках. Обработанные фосфатазой gRNA показали повышенную эффективность мутагенеза против гена CCR5, что привело к значительному снижению представления этого корецептора ВИЧ на поверхности клеток.

Эта работа объясняет цитотоксические эффекты иммуностимулирующих IVT gRNA в составе RNP комплексов CRISPR-Cas9 или Cpf1 и предлагает новый метод предотвращения иммунного ответа хозяина при сохранении высокой эффективности редактирования для терапевтического применения CRISPR.