Генная терапия с помощью CRISPR-Cas9 исправила заболевание печени у новорожденных мышей
Впервые исследователи вылечили животную модель генетического заболевания, используя вирусный вектор для доставки компонентов редактирования генома, которые исправляют вызывающую болезнь мутацию. Доставка вектора новорожденным мышам улучшила их выживаемость, в то время как лечение взрослых животных, неожиданно, ухудшило их состояние. Об этом сообщается в новом исследовании ученых из Медицинской школы Перельмана Пенсильванского университета, опубликованном в Nature Biotechnology.
Лаборатория Джеймса Уилсона сосредоточилась на печени как мишени для редактирования генов, используя векторы на основе аденоассоциированного вируса (AAV). Однако традиционная генная терапия с AAV не идеальна для лечения генетических заболеваний печени у новорожденных, так как недезующийся геном теряется при пролиферации клеток растущей печени.
Исследователи предположили, что печень новорожденного может быть идеальным органом для AAV-опосредованной коррекции генов с помощью технологии CRISPR-Cas9. При этом исправленная мутация сохранится, даже когда векторный геном будет утерян.
Испытание на модели мышей
Гипотезу проверили на мышиной модели редкого метаболического нарушения цикла мочевины, вызванного дефицитом фермента орнитинтранскарбамилазы (OTC). Мутация гена OTC находится на X-хромосоме. OTC-дефицит встречается у одного из 40 000 новорожденных.
Команда ввела два AAV (серотип AAV8, имеющий сродство к клеткам печени) новорожденным мышам с дефицитом OTC:
- Один AAV доставлял фермент Cas9 с помощью печеночно-специфичного промотера.
- Второй AAV доставлял направляющую РНК (guide RNA) и матричную ДНК (donor DNA) для коррекции мутации.
Эта система коррекции работает по принципу "Вырезать и Вставить" (Cut-and-Paste), где этап "Вставки" зависит от собственного механизма репарации ДНК клетки.
Результаты
У новорожденных мышей инъекция системы AAV обратила мутацию в среднем в 10% клеток печени. Это привело к повышению выживаемости молодых мышей на диете с высоким содержанием белка. Более 30% нелеченых мышей с дефицитом OTC умерли в течение недели, а уровень аммиака у них был значительно выше, чем у мышей с откорректированными генами.
У взрослых мышей (8-10 недель) коррекция гена с использованием той же системы была ниже. Более того, у них наблюдалась сниженная толерантность к белку и смертельная гипер-аммониемия даже на обычном корме. Мыши на высокой дозе терапии начали умирать через девять дней после инъекции.
Объяснение неожиданного результата
Исследователи обнаружили, что в клетках печени взрослых мышей частота успешной коррекции гена ("Вставки") составляла всего около 1%. Более проблематичным и совершенно неожиданным было то, что многие нескорректированные гены содержали крупные делеции, которые устраняли остаточную активность мутантного гена OTC.
Процесс коррекции включает:
- "Вырезание" (Cut): создание разрыва в ДНК с помощью Cas9.
- "Вставка" (Paste): в присутствии матричной ДНК разрыв исправляется путем гомологичной рекомбинации (homology directed repair, HDR).
Оказалось, что HDR более эффективен в клетках печени новорожденных, чем взрослых. В отсутствие HDR клетка восстанавливает разрыв с помощью другого процесса — негомологичного соединения концов (non-homologous end joining, NHEJ), который оставляет после себя небольшие вставки или делеции. У взрослых мышей NHEJ приводил к гораздо более крупным делециям, разрушавшим остаточную функцию гена OTC.
Низкая частота успешной "Вставки" в сочетании с "Вырезанием", разрушающим оставшуюся функцию гена во многих клетках, привела к снижению толерантности к белку у взрослых мышей.
Выводы и дальнейшие шаги
Неблагоприятные последствия редактирования генов, наблюдаемые у взрослых мышей с OTC, ограничены лечением генетических заболеваний, при которых мутация уменьшает, но не устраняет функцию гена. Чтобы избежать этой проблемы у взрослых пациентов, команда исследует методы создания "Вырезания", не провоцирующего крупные делеции, одновременно повышая частоту успешной "Вставки".