Новый метод идентифицирует нецелевые сайты разреза CRISPR-Cas нуклеаз по всему геному

Исследователи из Массачусетской больницы общего профиля (MGH) разработали метод обнаружения нежелательных разрывов ДНК, индуцированных использованием популярных инструментов редактирования генов CRISPR-Cas RNA-guided nucleases (RGNs), во всем геноме человеческих клеток. Члены той же команды, которая первой описала эти нецелевые эффекты в человеческих клетках, представляют свою новую платформу под названием Genome-wide Unbiased Identification of DSBs Evaluated by Sequencing (GUIDE-seq) в статье, опубликованной онлайн в Nature Biotechnology.

GUIDE-seq — это первый метод, который чувствительно обнаруживает нецелевые разрывы ДНК, индуцированные CRISPR-Cas нуклеазами, по всему геному, не начиная с предположения, что эти нецелевые сайты похожи на целевые. Эта способность, которой раньше не существовало, критически важна для оценки любого клинического использования CRISPR-Cas RGNs.

CRISPR-Cas RGNs, используемые для разреза двойной цепи ДНК с целью внесения генетических изменений, могут также индуцировать двухцепочечные разрывы (DSBs) в сайтах, значительно отличающихся от целевого, включая несовпадения до пяти нуклеотидов. Поскольку такие нецелевые мутации потенциально могут привести к неблагоприятным эффектам, включая рак, возможность идентифицировать и в конечном итоге минимизировать нежелательные DSBs необходима для безопасного клинического использования этих RGNs.

Разработанный метод включает использование коротких двухцепочечных олигонуклеотидов, которые захватываются DSBs в ДНК клетки, выступая в качестве маркеров нецелевых разрывов. Эти метки позволяют идентифицировать и секвенировать соответствующие геномные регионы, точно определяя местоположение нецелевых мутаций.

Эксперименты с GUIDE-seq показали, что метод достаточно чувствителен, чтобы обнаруживать нецелевые сайты, на которых CRISPR RGNs индуцируют нежелательные мутации гена с частотой всего 0,1% в популяции клеток. Эти эксперименты также выявили, что, поскольку многие такие мутации происходят в сайтах, довольно сильно отличающихся от целевого, не существует простых правил для предсказания количества или местоположения нецелевых DSBs.

Два существующих инструмента, предназначенных для предсказания нецелевых мутаций путем анализа целевой последовательности, оказались гораздо менее эффективными, чем GUIDE-seq, и также ошибочно идентифицировали сайты, которые не были разрезаны ферментом. Сравнение с инструментом ChIP-seq подтвердило, что ChIP-seq не является надежным методом для идентификации CRISPR-Cas-индуцированных DSBs.

GUIDE-seq также смог идентифицировать хотспоты разрывов в контрольных клеточных линиях, не индуцированных на экспрессию CRISPR RGNs. Способность захватывать эти RGN-независимые разрывы предполагает, что GUIDE-seq может быть полезным инструментом для изучения и мониторинга репарации ДНК в живых клетках.

Кроме того, GUIDE-seq подтвердил, что подход, разработанный в MGH для повышения точности CRISPR-Cas путем укорочения направляющей РНК, снижает количество DSBs по всему геному. Ожидается, что GUIDE-seq будет полезен для идентификации нецелевых разрывов, индуцированных другими инструментами редактирования генов.

Метод GUIDE-seq прост в выполнении, и программное обеспечение для анализа данных секвенирования будет доступно некоммерческим исследователям на сайте http://www.jounglab.org/guideseq. На технологию GUIDE-seq подана патентная заявка.