Сокращение направляющей РНК значительно повышает специфичность CRISPR-Cas нуклеаз

Простое изменение в мощном инструменте редактирования генов может повысить его специфичность. Исследователи из Массачусетской больницы общего профиля (MGH) сообщают, что изменение длины направляющей РНК (gRNA) в составе синтетических ферментов CRISPR-Cas (РНК-направляемых нуклеаз, RGNs) может существенно снизить частоту мутаций ДНК в нецелевых участках. Это ограничение команда описала в прошлом году.

  • Суть метода: Простое укорочение целевой области gRNA привело к снижению частоты нежелательных мутаций на всех изученных ранее известных нецелевых сайтах. На некоторых участках частота мутаций снизилась в 5000 раз и более по сравнению с полноразмерными gRNA.
  • Эффективность: Эти укороченные gRNA, названные tru-gRNAs, так же эффективны в нацеливании на нужные сегменты ДНК, как и полноразмерные.
  • Предыстория: В 2013 году команда обнаружила, что CRISPR-Cas RGNs в человеческих клетках могут вызывать мутации в последовательностях ДНК, отличающихся от цели до пяти нуклеотидов, что ограничивает клиническую применимость.
  • Гипотеза: Эксперименты 2013 года намекали, что несовпадение нескольких нуклеотидов на одном конце gRNA не влияет на активность. Это привело к вопросу: может ли удаление этих нуклеотидов сделать систему более чувствительной к несовпадениям в оставшейся последовательности?
  • Эксперимент: Стандартная система использует gRNA с 20-нуклеотидной целевой областью. Команда MGH создала RGNs с постепенно укорачивающимися gRNA и обнаружила, что сегменты длиной 17 или 18 нуклеотидов были так же или более эффективны, а сегменты из 15-16 нуклеотидов теряли активность.
  • Результат: RGNs с 17-нуклеотидными tru-gRNAs эффективно вызывали целевые мутации в человеческих клетках с резко сниженными или необнаруживаемыми нецелевыми эффектами, даже на сайтах с всего одним или двумя несовпадениями.
  • Возможный механизм: Исходная система может иметь больше энергии, чем нужно, что позволяет ей разрезать даже неидеально совпадающие сайты. Укорачивание gRNA, возможно, снижает энергию до уровня, достаточного только для работы на цели, делая нуклеазу менее способной разрезать нецелевые сайты. Точный механизм требует дальнейшего изучения.
2014-01-26