Более эффективный метод обнаружения нецелевых изменений генома от базовых редакторов

Исследователи из St. Jude Children's Research Hospital представили новый метод оценки безопасности технологии прецизионного редактирования генома. Значительные усилия по улучшению технологии CRISPR-Cas9 направлены на выявление небольших нецелевых сайтов редактирования, что представляет собой сложную техническую задачу.

Ученые St. Jude создали метод Circularization for High-throughput Analysis of Nuclease Genome-wide Effects by Sequencing Base Editors (CHANGE-seq-BE). Это объективный, чувствительный и ресурсоэффективный метод для поиска нецелевых редактирований, который превосходит традиционные подходы и уже используется для поддержки клинической работы. Техника опубликована в Nature Biotechnology.

В отличие от традиционного CRISPR-Cas9, который разрезает ДНК, базовые редакторы могут находить и заменять отдельные пары оснований ДНК.

"Мы разработали CHANGE-seq-BE, чтобы ученые могли лучше понять базовые редакторы — важный класс прецизионных CRISPR-редакторов генома", — сказал Шэндар Цай, доктор философии, автор-корреспондент. "Это простой и оптимизированный способ понять глобальную активность базовых редакторов, который позволяет исследователям выбирать высокоспецифичные и активные редакторы и целевые комбинации для исследований или терапии".

Клиническое применение

Метод уже используется для поддержки клинических исследований. В статье представлен пример экстренного обращения в FDA для терапии базовым редактором синдрома X-HIGM (CD40L-дефицитная X-сцепленная гипер-IgM). CHANGE-seq-BE подтвердил 95.4% специфичности по целевому сайту для используемого редактора без значительной нецелевой активности, предоставив важные данные по безопасности.

"Это был действительно захватывающий пример поддержки экстренного запроса в FDA для быстрого лечения пациента", — отметил Цай.

Эффективность и объективность

CHANGE-seq-BE был создан, потому что традиционные методы оценки безопасности базовых редакторов вынуждены выбирать между всесторонним охватом и эффективным использованием ресурсов. CHANGE-seq-BE сочетает в себе оба преимущества.

Принцип работы метода:

1. Весь геном разделяется на крошечные кольца ДНК.
2. Кольца подвергаются воздействию тестируемого базового редактора.
3. Специальный фермент обнаруживает факт редактирования и "раскрывает" только те кольца ДНК, где оно произошло, в линейные цепи.
4. Линейные цепи ДНК селективно секвенируются, что требует значительно меньше ресурсов.

Метод оптимизирован для обоих основных типов базовых редакторов (адениновых и цитозиновых).

Сравнение с другими методами

При прямом сравнении CHANGE-seq-BE обнаружил почти все сайты, выявленные другими методами, а также множество сайтов, которые смог обнаружить только он.

"Мы показали, что этот объективный подход был более чувствительным, используя при этом только около 5% от объема данных секвенирования", — заявил Цай.

Полные экспериментальные протоколы и программное обеспечение для использования CHANGE-seq-BE описаны в исследовании. Техника уже интегрирована в планирование клинических испытаний в St. Jude и за его пределами в качестве инструмента оценки безопасности и эффективности. Ее также недавно использовали для характеристики первой персонализированной терапии редактирования генома in vivo.

"Мы надеемся, что такие методы, как CHANGE-seq-BE, откроют дверь для разработки большего количества терапий редактирования генома для пациентов, которые в них нуждаются", — заключил Цай.