Новый метод быстрого картирования "социальных сетей" белков

Ученые из Института Солка разработали новый высокопроизводительный метод для определения того, какие белки в клетке взаимодействуют друг с другом. Картирование этой сети взаимодействий, или "интерактома", ранее было медленным процессом, поскольку количество взаимодействий, которые можно было проверить за раз, было ограничено. Новый подход, опубликованный 26 июня в Nature Methods, позволяет исследователям проверять миллионы связей между тысячами белков в одном эксперименте.

Интерактом клетки, подобно карте социальных сетей, позволяет ученым видеть, кто с кем взаимодействует в мире белков. Это помогает определить роли различных белков и собрать воедино участников молекулярных путей и процессов.

До сих пор исследователи обычно полагались на стандартные высокопроизводительные дрожжевые двухгибридные анализы (Y2H), чтобы определить взаимодействия между белками. Эта система требует использования одного известного белка — "приманки" (bait) — для скрининга против пула белков-"жертв" (prey). Но поиск всех взаимодействий между, например, 1000 белков потребовал бы 1000 отдельных экспериментов.

В новом методе команда добавила модификацию к стандартному анализу Y2H для более эффективного измерения интерактома. Гены для двух белков, каждый на своей кольцевой молекуле ДНК, добавляются в одну клетку. Если интересующие белки взаимодействуют внутри клетки, активируется ген Cre. Когда он включен, Cre физически сшивает две отдельные кольцевые ДНК вместе, тем самым объединяя гены взаимодействующих белков, чтобы команда могла легко найти их с помощью секвенирования.

Исследователи могут создать огромную библиотеку дрожжевых клеток — каждая содержит разные пары белков, вводя случайные комбинации генов на кольцевых ДНК, называемых плазмидами. Когда клетки демонстрируют положительный результат на взаимодействие белков, ученые могут использовать генетическое секвенирование, чтобы определить, какие именно два белка взаимодействуют, с помощью новых высокопроизводительных технологий секвенирования ДНК, аналогичных тем, что используются для секвенирования человеческого генома. Таким образом, они больше не ограничены тестированием одной белка-приманки за раз, а могут проверять взаимодействия между всеми белками в библиотеке одновременно.

Группа Эккера протестировала новый метод, названный CrY2H-seq, на всех факторах транскрипции — большом классе белков — у растения Arabidopsis.

"Когда вы берете 1800 белков и проверяете взаимодействия между ними, это почти 4 миллиона комбинаций. Мы сделали это десять раз в течение месяца", — говорит Джозеф Эккер.

Они выявили более 8000 взаимодействий среди протестированных белков, получив новое представление о том, какие факторы транскрипции Arabidopsis взаимодействуют друг с другом. Некоторые из малоизученных факторов транскрипции, как выяснилось, взаимодействуют с более изученными факторами, регулирующими реакцию растения на ауксин — гормон, участвующий в координации роста растений.

В будущем метод можно будет масштабировать для тестирования более крупных наборов белков — например, человеческие клетки содержат около 20 000 различных белков. Этот более простой и быстрый метод определения всего интерактома клетки также открывает возможность изучения того, как интерактом изменяется в различных условиях — эксперимент, который ранее был невозможен.