Новый лабораторный метод раскрывает структуру и функцию белков, критически важных для репарации ДНК

Учёные из Университета Иллинойса в Урбане-Шампейне впервые одновременно наблюдали структуру и коррелирующую с ней функцию специфических белков, критически важных для репарации ДНК. Для этого они объединили две высокоинновационные экспериментальные методики. Результаты дают окончательные ответы на некоторые горячо обсуждаемые вопросы и открывают новые направления исследований и захватывающие возможности для биологической инженерии.

До недавнего времени самые передовые лабораторные эксперименты могли исследовать только что-то одно — статичную форму или динамическую функцию белковых молекул — и по результатам делать выводы о другом. Этот косвенный метод часто не давал окончательных ответов.

Теперь биологи-физики Тэкджип Ха и Янн Хемла объединили две передовые лабораторные методики, которые вместе напрямую исследуют взаимосвязь структуры и функции белков. Метод одновременной флуоресцентной микроскопии и оптического пинцета даёт гораздо более определённые ответы, чем каждая методика по отдельности.

Результаты экспериментов опубликованы в двух отдельных статьях в выпуске журнала Science от 17 апреля.

Исследование белка UvrD

Команда лаборатории Хемлы изучала взаимосвязь структуры и функции в хеликазе UvrD — белке, обнаруженном в бактерии E. coli, который разделяет нити ДНК, нуждающиеся в репарации, путём их расплетания и расстёгивания.

• Количество белков для работы: Используя флуоресцентную метку для подсчёта белков и оптический пинцет для наблюдения за расплетанием, команда обнаружила, что один UvrD может расплетать ДНК, но недалеко и с возвратно-поступательным движением («фрустрированный» режим). Две молекулы UvrD расплетают ДНК гораздо дальше и стабильнее.
• Связь структуры и функции: Используя smFRET (флуоресцентный резонансный перенос энергии на одиночной молекуле) с двумя красителями, команда определила, находится ли молекула в «открытом» или «закрытом» состоянии. Наблюдения с оптическим пинцетом показали, что молекула переключается между состояниями.
  • Закрытое состояние расплетает нити ДНК, используя действие, подобное крутящему моменту.
  • Открытое состояние позволяет нитям снова спариваться.

Инженерный подход с белками Rep и PcrA

Команда лаборатории Ха сконструировала структурно гомологичный хеликазный белок Rep, фиксируя его в закрытом или открытом состоянии с помощью сшивающей молекулы, как «скотчем».

• Результаты:

  • При фиксации в закрытом положении белок превратился в «суперхеликазу», способную расплетать двуцепочечную ДНК на большом расстоянии.
  • При фиксации в открытом положении хеликаза была неработоспособна.

• Эксперимент был повторён на другом структурно гомологичном хеликазном белке PcrA с тем же результатом. Команда также показала, как другой белок, взаимодействующий с PcrA и повышающий его эффективность, физически достигает этой цели: его добавление фиксирует PcrA в закрытом состоянии.

Значение и перспективы

«Суперхеликаза, которую мы сконструировали на основе нашего фундаментального понимания функции хеликаз, может быть использована как мощный биотехнологический инструмент, например, для чувствительного обнаружения патогенной ДНК в удалённых районах», — комментирует Тэкджип Ха.

«Белки гибки, — объясняет Янн Хемла. — Каждый может выполнять несколько функций. Присутствие других белков может определять, какая функция активна, изменяя его структуру».

Эта работа открывает новые возможности для биологической инженерии, включая быстрое секвенирование ДНК с помощью нанопорной технологии.