Двухсторонний контроль ATR, главного регулятора контрольной точки повреждения ДНК
Наши геномы постоянно сталкиваются с повреждениями ДНК. По мере накопления повреждений клетки реагируют и останавливают процесс деления, давая время на работу механизмам репарации. Для этого два главных протеинкиназы, ATR и ATM, кодируемые известными генами-супрессорами опухолей, активируют каскад фосфорилирования. Хотя результат работы этих каскадов хорошо изучен, регуляция самой главной киназы оставалась загадкой.
Николь Хустедт, студентка лаборатории Сьюзан Гассер, исследовала этот вопрос с помощью комбинации сложной генетики дрожжей и фосфопротеомики. Она обнаружила, что ключевым регулятором киназы Mec1 у дрожжей (гомолога ATR) является фосфатаза, которая напрямую обращает модификацию многих мишеней этой киназы, индуцированных повреждением. Идентифицированная фосфатаза, названная PP4, не только дефосфорилирует мишени Mec1, но и напрямую взаимодействует с киназой, тонко настраивая её активность в течение клеточного цикла.
Это указывает на замечательный регуляторный принцип: главная киназа ATR/Mec1, по-видимому, уравновешивается фосфатазой, с которой она образует комплекс. Этот химерный комплекс тонко настраивает ответ контрольной точки повреждения ДНК, позволяя клеткам переживать повреждения.
Открытие с помощью E-MAP и фосфопротеомики
Чтобы раскрыть механизмы регуляции вышестоящей киназы контрольной точки, группа Сьюзан Гассер в Институте биомедицинских исследований Фридриха Мишера использовала мощную генетическую технологию E-MAP, оптимизированную на почкующихся дрожжах. Комбинируя синтетические генетические взаимодействия с фосфопротеомикой, было обнаружено новое регуляторное взаимодействие, контролирующее контрольную точку повреждения ДНК во время репликации генома.
E-MAP позволяет идентифицировать пары генов, которые действуют вместе или антагонистично в данном процессе. Применяя этот метод к ответу на повреждение ДНК, регулируемому Mec1, Николь Хустедт обнаружила, что только одна пара генов может эффективно противодействовать дефектам в каскаде Mec1, когда он активируется повреждением репликационной вилки. Этими генами оказались кодирующие субъединицы фосфатазы PP4.
Исследование, опубликованное в Molecular Cell, показало, что фосфатаза PP4 (Pph3-Psy2) регулирует большое количество мишеней фосфорилирования Mec1. Таким образом, она способствует балансу между фосфорилированием и дефосфорилированием. Это позволяет быстро и эффективно реагировать на активацию контрольной точки и, в конечном итоге, возобновлять клеточный цикл. Интригующе, что фосфатаза PP4 физически взаимодействует с Mec1, образуя комплекс, содержащий как киназу, так и фосфатазу.
«Два фермента действуют согласованно, но противоположным образом, что легко позволяет тонко настраивать активность Mec1 в течение клеточного цикла, — комментирует Гассер. — Противодействующие модификации — это инь и ян контрольной точки повреждения ДНК».
Консервация механизма
Механизмы контроля клеточного цикла и активации контрольных точек консервативны между организмами. Mec1 и Pph3-Psy2 имеют гомологи у млекопитающих, которые также взаимодействуют.
«Изучив взаимодействия в дрожжах, мы смогли совершить скачок к человеческим клеткам и показать, что регуляция гомолога Mec1 у млекопитающих, ATR, использует тот же механизм, — говорит Гассер. — Это помогает нам понять процессы, обеспечивающие целостность генома и предотвращающие онкогенную трансформацию».