Криоэлектронная микроскопия высокого напряжения раскрывает тайны «гигантских» вирусов
Несмотря на название, детальная визуализация гигантских вирусов сложна. Они слишком велики для обычной электронной микроскопии, но слишком малы для оптической. Впервые международная коллаборация с помощью крио-высоковольтной электронной микроскопии (крио-HVEM) раскрыла структуру токиовируса — гигантского вируса, открытого в Токио в 2016 году.
Результаты опубликованы 11 декабря в Scientific Reports.
«Гигантские вирусы» — это вирусы исключительно большого физического размера, больше мелких бактерий, с гораздо большим геномом, чем у других вирусов. Немногие исследования детально раскрывали структуру капсида — белковой оболочки, инкапсулирующей двуцепочечную вирусную ДНК — крупных икосаэдрических (20-гранных) вирусов. Их размер накладывает жесткие ограничения на сбор данных для высокоразрешающей криоэлектронной микроскопии.
Чтобы преодолеть это, исследователи использовали одну из немногих в мире установок высоковольтной электронной микроскопии (HVEM), приспособленных для биологических образцов. Такой микроскоп ускоряет напряжение, чтобы теоретически увеличить мощность и позволить визуализировать более толстые образцы с высоким разрешением.
В Исследовательском центре электронной микроскопии сверхвысокого напряжения при Университете Осаки команда сняла мгновенно замороженные частицы токиовируса, чтобы впервые реконструировать отдельную частицу в полной детали.
«Крио-HVEM для биологических образцов ранее не применялась для анализа единичных частиц. Для толстых образцов, таких как токиовирус с максимальным диаметром 250 нанометров, влияние глубины резкости вызывает внутренний сдвиг фокуса, накладывая жесткий предел на достижимое разрешение. Ускорение напряжения, или укорочение длины волны испускаемых электронов, может увеличить глубину резкости и улучшить оптические условия для толстых образцов», — пояснил соавтор исследования.
С этими настройками ученые детально визуализировали токиовирус, чтобы прояснить структуру полной вирусной частицы. Они достигли 3D-реконструкции с разрешением 7.7 ангстрем — чуть ниже теоретически возможного для технологии. Это ограничение было связано с объемом собранных данных.
«Крио-HVEM в настоящее время требует ручного сбора микрофотографий. Мы идентифицировали 1182 частицы из 160 микрофотографий — крайне малое число по сравнению с отчетами по другим гигантским вирусам, снятым менее мощными микроскопами».
Низкое увеличение повышает число частиц на микрофотографии, но увеличение должно быть достаточно высоким для детальной съемки. Автоматический сбор микрофотографий, рутинно используемый в стандартной крио-ЭМ, значительно увеличивает число снимков при высоком увеличении, но ручной режим позволил исследователям сохранить лучшее соотношение числа частиц на снимке при более высокой частоте дискретизации.
Даже с ограниченными образцами и слегка сниженным разрешением ученые собрали достаточно информации, чтобы лучше понять структуру частицы гигантского вируса с большей ясностью, чем когда-либо прежде.
«Карта крио-HVEM выявила новую сеть капсидных белков, включая сеть компонентов белка-скаффолда. Эта каркасная сеть, соединяющая вершины в икосаэдрической частице, может определять размер частицы».
Икосаэдрические гигантские вирусы, включая токиовирус, имеют большие функциональные «клетки» единого размера, созданные из ограниченного набора компонентов для защиты вирусного генома и заражения клетки-хозяина. Ученые начинают понимать, как это работает, включая расширенные функции структур и возможные применения этих знаний.
Исследователи планируют внедрить программное обеспечение для автоматического сбора данных, способное поддерживать нужные параметры, чтобы снять больше структур гигантских вирусов и обнаружить общую архитектуру. Это поможет лучше понять, как ограниченные структуры могут использоваться многофункциональными организмами.