Метод визуализации позволяет увидеть «симфонию клеточной активности»

Внутри одной клетки тысячи молекул, таких как белки, ионы и другие сигнальные молекулы, работают вместе, выполняя различные функции — от усвоения питательных веществ до хранения воспоминаний и дифференцировки в специфические ткани.

Расшифровка этих молекул и их взаимодействий — грандиозная задача. За последние 20 лет ученые создали флуоресцентные репортеры для отслеживания динамики отдельных молекул в клетках. Однако обычно можно наблюдать только один или два сигнала одновременно, поскольку микроскоп не может различить множество флуоресцентных цветов.

Исследователи MIT разработали способ одновременной визуализации до пяти различных типов молекул, измеряя каждый сигнал из случайных, различных мест внутри клетки. Этот подход может позволить ученым узнать гораздо больше о сложных сигнальных сетях, контролирующих большинство функций клетки.

«Существуют тысячи молекул, закодированных в геноме, и они взаимодействуют способами, которые мы не понимаем. Только наблюдая за ними одновременно, мы можем понять их взаимосвязи», — говорит профессор Эдвард Бойден, старший автор исследования, опубликованного в журнале Cell.

Флуоресцентные кластеры

Обычно репортеры создают, соединяя белок, чувствительный к целевой молекуле, со светящимся белком, например, зеленым флуоресцентным белком (GFP). Проблема в том, что большинство репортеров светятся зеленым, и микроскоп не может различить много цветов одновременно.

Чтобы увеличить количество наблюдаемых сигналов, исследователи решили идентифицировать их не по цвету, а по местоположению. Они модифицировали существующие репортеры, добавив к каждому два небольших пептида, которые заставляют репортеры образовывать отдельные кластеры внутри клетки.

«Это как если бы репортер X был привязан к кирпичику LEGO, а репортер Z — к детали K'NEX. Только LEGO будут соединяться с другими LEGO, заставляя репортер X кластеризоваться только с репортером X», — объясняет аспирант Шэннон Джонсон.

В результате в каждой клетке образуются сотни кластеров флуоресцентных репортеров. Измерив активность каждого кластера под микроскопом по изменению флуоресценции, исследователи могут определить, какая молекула измерялась в каждом кластере, фиксируя клетку и окрашивая уникальные пептидные метки для каждого репортера. Эти метки невидимы в живой клетке, но их можно окрасить после завершения визуализации в реальном времени.

Используя этот подход, исследователи показали, что могут видеть пять различных молекулярных сигналов в одной клетке. В качестве демонстрации они измерили параллельную активность трех молекул — кальция, циклического АМФ и протеинкиназы A (PKA). Эта сигнальная сеть участвует во многих клеточных функциях по всему организму. В нейронах она играет ключевую роль в преобразовании кратковременного входного сигнала в долгосрочные изменения, такие как усиление связей между нейронами, что необходимо для обучения и формирования новых воспоминаний.

Применив эту технику визуализации к пирамидальным нейронам гиппокампа, исследователи выявили две новые субпопуляции с разной динамикой кальциевых сигналов:

• Одна популяция показала медленные кальциевые ответы.
• В другой популяции нейроны демонстрировали быстрые кальциевые ответы и более сильные ответы PKA.

Исследователи полагают, что этот усиленный ответ PKA может способствовать поддержанию долговременных изменений в нейронах.

Перспективы метода

В планах исследователей — опробовать этот подход на живых организмах, чтобы изучить связь активности сигнальных сетей с поведением, а также расширить его на другие типы клеток, например, иммунные. Метод также может быть полезен для сравнения паттернов сигнальных сетей в клетках здоровых и пораженных болезнью тканей.

В данной работе ученые одновременно регистрировали пять молекулярных сигналов. Модифицируя свою стратегию, они считают возможным достичь 16 сигналов, а в перспективе — и сотен.

«Это действительно может помочь решить некоторые сложные вопросы о том, как части клетки работают вместе. Можно представить эру, когда мы сможем наблюдать за всем, что происходит в живой клетке, или, по крайней мере, за частью, связанной с обучением, болезнью или лечением», — говорит Эдвард Бойден.