Улучшенные флуоресцентные аминокислоты для визуализации в клетках
Исследователи из лаборатории Э. Джеймса Петерсона в Университете Пенсильвании совместно с Университетом штата Орегон и Вашингтонским университетом разработали метод включения в белки живых клеток синтетических флуоресцентных аминокислот. Эти метки яркие, долговечные и способны "чувствовать" своё окружение. Метод упрощает изучение белков, что важно для исследования механизмов сложных неврологических заболеваний. Результаты опубликованы в Chemical Science, а два связанных исследования — в eLife и Scientific Reports.
Лаборатория Петерсона давно занимается разработкой новых способов мечения белков флуоресцентными метками, особенно таких как тау- и альфа-синуклеин, связанных с болезнями Альцгеймера и Паркинсона. Обычно для отслеживания белков используют крупные метки вроде зелёного флуоресцентного белка (GFP), что затрудняет изучение малых белков (альфа-синуклеин вдвое меньше GFP). Существующие меньшие метки часто токсичны для долгосрочных наблюдений за живыми клетками.
Альтернативный подход лаборатории Петерсона — химический синтез флуоресцентных версий аминокислот (строительных блоков белков) и их внедрение в белки с помощью инженерных ферментов прямо в живой клетке. Это позволяет получить меченый белок, который ведёт себя точно так же, как нативный.
Ранее лаборатории удавалось внедрять в белки бактерий искусственную аминокислоту аридонилаланин (Acd), но не в клетках млекопитающих, более релевантных для изучения болезней человека. Теперь, благодаря сотрудничеству с другими университетами, аспиранту Хлои Джонс удалось объединить методы синтетической органической химии, молекулярной биологии и микроскопии для включения Acd в белки в клетках млекопитающих.
Ключевые этапы работы:
- Направленная эволюция в E. coli (лаборатория Райана Мела, Орегон): с помощью инженерных аминоацил-тРНК-синтетаз часть генетического кода была "перепрограммирована" для вставки Acd. Определены наиболее эффективные мутантные синтетазы.
- Перенос в клетки млекопитающих (экспертиза Уильяма Заготты и Шароны Гордон, Вашингтон), имевших опыт работы с неестественными аминокислотами в нейрональных ионных каналах.
Преимущества Acd (опубликовано в Chemical Science):
- Высокая фотостабильность: флуоресценция не деградирует в длительных экспериментах.
- Высокий квантовый выход: метка светится ярче аналогов.
- Долгое время флуоресценции: позволяет детектировать изменения в микроокружении метки (например, при связывании с другим белком или приближении к мембране).
Исследование в eLife (Заготта и Гордон):
Показано, что Acd можно использовать в паре с металл-ионными зондами для измерения расстояний в белках при изменении их формы. Благодаря долгому времени жизни Acd является превосходным донором флуоресценции для этого метода, что поможет изучать структурные изменения в ионных каналах нейронов.
Исследование в Scientific Reports (лаборатория Петерсона):
С помощью компьютерного моделирования и машинного обучения разработаны алгоритмы, предсказывающие оптимальные места для вставки Acd в белок, чтобы его поведение оставалось идентичным нативному.
Перспективы:
- Создание флуоресцентных аминокислот других цветов (зелёного, жёлтого, красного) на основе той же платформы, что позволит отслеживать несколько типов белков в одной клетке без использования громоздких меток вроде GFP.
- Применение метода для изучения механизмов нейродегенеративных заболеваний (Паркинсона, Альцгеймера) в клеточных моделях, в частности, для наблюдения за изменениями в клетке при токсической агрегации белков.