Создание новой палитры цветов для визуализации одиночных молекул

Исследователи часто изучают биомолекулы, такие как белки или аминокислоты, химически присоединяя к ним "флуорофор" — чувствительную молекулу, которая поглощает и переизлучает энергию света.

При активации лазером и визуализации через мощный микроскоп эти флуоресцентные метки вспыхивают радугой цветов, предоставляя информацию, которая может, например, помочь в обнаружении болезней или генетических состояний.

Для одновременного обнаружения нескольких типов молекул, или "мультиплексирования", используются дополнительные типы флуорофоров, излучающих свет разных цветов. Но на уровне одиночных молекул неожиданно сложно различить разные цвета. Поэтому большинство микроскопов работают только с тремя-четырьмя цветами.

Преодолеть этот цветовой барьер можно с помощью сложных методик, требующих много дней маркировки и визуализации, или сложных установок с множеством лазеров. Однако поиск простого и быстрого способа увидеть много цветов оставался серьёзной проблемой.

Исследователи из Школы молекулярной инженерии Притцкера Чикагского университета предложили новое решение, описанное в статье, опубликованной в Nature Nanotechnology. Новая методика, разработанная в лаборатории Сквайрс, использует три простых химических строительных блока для создания десятков меток "FRETfluor", формируя более красивый и тонкий спектр цветов для маркировки биомолекул.

"Наш подход проще. Это один этап маркировки, один этап визуализации", — сказал соавтор Цзячун Чу, кандидат наук. — "Это значит, что можно сделать больше с меньшими затратами. В настоящее время наша новая методика — лучшая в этой области".

Новый путь к мультиплексированию

Отдельные молекулы малы, а образцы клеток, напротив, огромны, сложны и "загрязнены". Конечная цель этого направления исследований, к которой команда PME приблизилась как никогда, — мультиплексирование.

"Мультиплексирование образцов означает возможность в одном измерении детектировать более одного вида молекул — может быть, 10, 50 или сотни разных белков, которые вы хотите идентифицировать", — сказала доцент молекулярной инженерии Эллисон Сквайрс. — "С этой новой техникой мы можем работать с десятками. Я верю, что мы можем расширить это до сотен".

Для решения этой задачи команда лаборатории Сквайрс нашла инновационный способ использовать хорошо известную методику: фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET). FRET — это механизм, описывающий, как энергия передаётся между светочувствительными молекулами. Это один из способов для исследователей измерить расстояние между разными частями молекулы или зафиксировать взаимодействие двух молекул. Сигналы FRET исключительно чувствительны к свойствам участвующих флуорофоров, что команда UChicago использовала для настройки своих меток FRETfluor.

"Этот проект использует FRET по-новому", — сказала соавтор Айеша Эйяз, кандидат наук по химии. — "FRET обычно используется для измерения расстояний и наблюдения динамики в биомолекулах. Мы изменили расстояние между донорным и акцепторным красителем, чтобы создать разные эффективности FRET и другие свойства, которые мы используем для идентификации различных конструкций".

27 меток, использованных в исследовании команды PME, были 27 "FRETfluors", которые они сконструировали, используя простую комбинацию ДНК, зелёного цианинового красителя (Cy3) и красного цианинового красителя (Cy5). Помимо свечения разными цветами, каждый FRETfluor демонстрирует другие настраиваемые свойства, такие как время испускания фотонов или их ориентация.

Вместе эти свойства можно использовать для идентификации FRETfluor за доли секунды при сверхнизких концентрациях. Эйяз отметила, что одно из возможных будущих направлений исследований — в конечном итоге заменить обычные флуоресцентные метки на эти FRETfluors.

"Обычно, когда люди хотят одновременно смотреть на несколько объектов — например, разные части клетки — они маркируют каждый компонент разным флуоресцентным тегом, который излучает свет определённого цвета. Но флуоресцентные теги ограничены четырьмя или пятью цветами", — сказала Эйяз.

"Если вместо них можно будет использовать FRETfluors, то мы сможем увеличить количество 'цветов', доступных для флуоресцентной микроскопии. Мы сейчас тестируем, насколько хорошо FRETfluors работают в разных типах экспериментов и средах, что даст нам лучшее понимание всех возможностей".

Чувствительность и простота

Для Сквайрс большая часть привлекательности новой методики мультиплексирования заключается в сочетании чувствительности с простотой.

"Все хотят мультиплексировать свой любимый анализ, и существует множество существующих стратегий, которые работают в определённых ситуациях", — сказала она. — "Есть техники, которые хорошо работают, когда у вас много времени или когда ваш образец мёртв и ничего не движется.

Мы атакуем проблему, когда у вас нет много времени. Вы хотите знать, какая у кого-то болезнь, пока ещё есть время с ней бороться, или у вас есть лишь крошечный кусочек образца, и у вас есть только один шанс идентифицировать каждую молекулу, когда она протекает через ваш канал. Мы можем идентифицировать FRETfluors за доли секунды при концентрациях до десятков фемтомолей".

Ключевым моментом является простота — как в использовании распространённых химических веществ для создания FRETfluors, так и в разработке методики, которой для считывания нужен только один лазер.

"Мы маркируем мишень только один раз и считываем сигнал только один раз", — сказал Чу. — "В этом контексте мы можем создать 27 разных меток, которые можно использовать одновременно".

Сквайрс описала, как существующие техники можно использовать вместе с FRETfluors для ещё большего увеличения мультиплексирования — "можно ввести сложные схемы лазерного возбуждения или включить другие флуорофоры, имеющие несколько иные свойства", — что улучшит считывание с существующих меток.

Применение этих множителей к их новой, более мощной методике, по словам Сквайрс, может открыть миры для новых исследований и применений.

"Эти улучшения в визуализации и проточных биомедицинских анализах позволят совершить следующее поколение инноваций", — сказала Сквайрс.