Новый метод точечного выключения генов дрожжей

Как заставить дрожжи работать эффективнее? Речь не о выпечке хлеба, а о процессах получения химикатов и фармацевтических препаратов. В промышленности используют дрожжи Saccharomyces cerevisiae, и их производительность хотят повысить. Ключ — в манипуляции генетическим кодом дрожжей.

Исследователи разработали метод, который позволяет целенаправленно «выключать» гены, внося мутации. Подход удаляет конкретные точки в последовательности ДНК, что позволяет изучать влияние каждой делеции: приводит ли она к остановке работы дрожжей в определённых химикатах или замедляет их рост. Метод позволяет изучать гены как по отдельности, так и в комбинации, создавая библиотеки мутантов для исследования функций каждого гена.

До сих пор подобные библиотеки генетических мутаций создавались только для более простых организмов — прокариот. Новая технология позволяет быстро сконструировать десятки тысяч мутаций в более сложных организмах с эффективностью таргетирования 98%. Это упрощает выявление и выделение штаммов-мутантов с нужными признаками, например, устойчивостью к токсичным соединениям, необходимым в промышленном производстве.

Метод получил название CHAnGE (CRISPRCas9- and homology-directed-repair-assisted genome-scale engineering). В его основе — библиотеки синтетических олигонуклеотидов (кассет), содержащих:

• направляющую последовательность CRISPR,
• генно-специфичные последовательности для таргетной гомологичной рекомбинации,
• уникальные штрих-коды для отслеживания каждого мутантного штамма.

Библиотеку олигонуклеотидов клонировали в плазмиду и внедрили в Saccharomyces cerevisiae. Было синтезировано почти 25 000 последовательностей, представляющих почти каждый из 6500 открытых рамок считывания дрожжей.

Результаты:

• Более 98% кассет CHAnGE приводили к мутациям в целевых генах как минимум в 82% случаев, что демонстрирует высокую эффективность редактирования.
• Технология эффективна для внесения как небольших делеций и однонуклеотидных мутаций, так и для насыщающего мутагенеза отдельного гена или домена.
• CHAnGE успешно применили для создания штаммов дрожжей, толерантных к фурфуролу. Это указывает на потенциал метода для инженерии промышленно значимых эукариот с целью развития возобновляемого производства биотоплива и ценных химикатов.