Оптимизация системы Tet-On для гомогенной миогенной дифференцировки iPSC

В недавнем исследовании, опубликованном в iScience, ученые оптимизировали систему Tet-On, чтобы повысить эффективность получения клеток скелетных мышц и других дифференцированных типов клеток из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) для фундаментальных и клинических исследований. Работу возглавили доцент Хидэтоши Сакураи и доцент Кнут Вольтьен.

Ключевой проблемой при получении дифференцированных клеток и тканей из iPSC является гетерогенность. Например, загрязнение недифференцированными или частично дифференцированными клетками создает проблемы с воспроизводимостью для моделирования заболеваний и вопросы безопасности для клеточной терапии.

Тетрациклин-индуцибельная система экспрессии генов (Tet-On) — это фундаментальный генетический инструмент, позволяющий регулировать экспрессию трансгена в ответ на доксициклин. Система основана на способности обратного тетрациклин-трансактиватора (rtTA) связываться с промотором Tet-On (состоящим из повторов Tet-оперона и минимального промотора цитомегаловируса, CMV) только в присутствии доксициклина, чтобы активировать экспрессию экзогенного гена.

Простота системы позволяет инициировать прямую дифференцировку iPSC в различные типы клеток. Однако неоднородная активация трансгена остается проблемой, что вынуждает исследователей оценивать и отбирать клоны iPSC для поиска тех, которые эффективно и стабильно экспрессируют целевой трансген.

Чтобы решить проблему гетерогенности, ученые сначала вернулись к основам, чтобы найти причину неудачной активации трансгена. Поскольку сверхэкспрессия MYOD1 является предпочтительным методом индукции миогенной дифференцировки из iPSC, исследователи сначала изучили способность системы экспрессии транспозазы piggyBac сверхэкспрессировать MYOD1 (с флуоресцентным репортерным белком mCherry для параллельной индикации экспрессии MYOD1), rtTA и маркер позитивной селекции на устойчивость к неомицину.

После введения системы piggyBac в iPSC и отбора клеток с интегрированной в геном системой, клетки обработали доксициклином для инициации миогенной дифференцировки. Важно, что не все клетки экспрессировали MYOD1, что указывало на то, что многие клетки не смогли включить трансген.

Чтобы определить причину, клетки разделили на флуоресцирующие и нефлуоресцирующие (по сигналу mCherry) для дальнейшего анализа. Интересно, что хотя в нефлуоресцирующих клетках был обнаружен экзогенный ген, экспрессия rtTA в них была значительно ниже по сравнению с флуоресцирующими клетками.

Исходя из этого наблюдения, ученые проверили, повысит ли дополнительная экспрессия rtTA эффективность миогенной дифференцировки. Как и предполагалось, добавление rtTA увеличило эффективность дифференцировки примерно с 40% до более чем 80%, что указало на то, что экспрессия rtTA может быть "узким местом" для дифференцировки iPSC.

Затем исследователи изучили другой фактор, влияющий на экспрессию трансгена: маркер позитивной селекции на устойчивость к антибиотику. Для проверки этого параметра они заменили трансген устойчивости к неомицину в системе piggyBac на ген устойчивости к пуромицину. Несмотря на то, что у клеток стало меньше копий трансгена с устойчивостью к пуромицину, они не только экспрессировали высокие уровни mCherry и rtTA, но и относительная доля клеток, экспрессирующих флуоресцентный репортерный белок, значительно возросла просто благодаря смене маркера устойчивости к антибиотику.

Далее ученые проверили, будет ли эта замена способствовать равномерной экспрессии MYOD1 и миогенной дифференцировке. Действительно, им удалось воспроизводимо достичь эффективности дифференцировки более 90%, используя селекцию на устойчивость к пуромицину.

Оптимизировав описанные факторы и другие параметры, исследовательская группа показала, что может успешно дифференцировать iPSC в клетки скелетных мышц с достаточной эффективностью, что делает ненужной оценку и отбор клонов. Эти новые знания позволяют исследователям применять аналогичные стратегии для других методов дифференцировки, необходимых для получения различных типов клеток с целью воспроизводимого моделирования заболеваний и безопасной клеточной терапии.