Новый метод SIP для анализа последовательностей ДНК рядом с известными участками
Ученые из Института зоологии и исследований дикой природы им. Лейбница (Leibniz-IZW), Австралийского музея и Центра молекулярной медицины им. Макса Дельбрюка (MDC) разработали новый метод определения любой последовательности генома, расположенной рядом с известным участком.
Проблема и решение
Часто сложно точно определить неизвестные последовательности, прилегающие к небольшим известным фрагментам. Полное секвенирование генома — дорогостоящее решение. Для поиска более эффективной техники ученые создали Sonication Inverse PCR (SIP):
- ДНК случайным образом разрезается ультразвуком.
- После фрагментации проводится длиннофрагментная обратная ПЦР.
- Затем выполняется высокопроизводительное секвенирование длинных фрагментов.
SIP позволяет охарактеризовать любую последовательность ДНК рядом с известной и может применяться как в клинической геномике, так и в молекулярно-эволюционных анализах. Результаты опубликованы в журнале Methods in Ecology and Evolution.
Преимущество перед существующими методами
Распространенные методы на основе обратной ПЦР имеют систематическую ошибку, так как используют ферменты, разрезающие ДНК в специфичных мотивах, которые распределены неравномерно. «SIP решает эту проблему, используя высокочастотные звуковые волны для случайного разрезания ДНК, что устраняет смещение, возникающее при использовании ферментов», — поясняет профессор Алекс Гринвуд из Leibniz-IZW. С развитием секвенирования длинных фрагментов авторы смогли анализировать продукты обратной ПЦР длиной 4–6 тысяч пар оснований на платформе PacBio RS II.
Тестирование на модели коалы
Метод был протестирован на сложной модели — ретровирусе коал (KoRV), который в большом количестве копий присутствует в геноме коалы (Phascolarctos cinereus). Нацелившись на концы интегрированного вируса, ученые смогли определить полный спектр вирусных интеграций в геноме, используя небольшой известный фрагмент вирусной ДНК. Сопоставление интеграций с референсными геномами позволило точно определить геномные локации для каждой интеграции. «Применение этого метода позволило нам обнаружить специфичный для коал защитный механизм против KoRV», — говорит доктор Ульрике Лёбер из MDC.
Перспективы и экономическая эффективность
«SIP экономичен и может быть одновременно применен ко многим образцам путем добавления штрих-кодов к праймерам ПЦР, что делает метод рентабельным», — добавляет доктор Дэвид Алькезар, бывший сотрудник Leibniz-IZW, а ныне руководитель Австралийского центра геномики дикой природы. Авторы продолжают применять SIP для решения различных проблем, например, изучения интеграции вирусов в геномы и механизмов вызываемых ими заболеваний.
В итоге, SIP предоставляет новый протокол для высокопроизводительного профилирования фланкирующих последовательностей рядом с любым интересующим регионом в сочетании с длиннофрагментным секвенированием, что позволяет изучать сложные биологические системы, такие как мобильные генетические элементы.