Улучшенная технология секвенирования РНК дает более глубокое понимание бактерий

Исследователи из Университета Юлиуса-Максимилиана в Вюрцбурге (JMU) усовершенствовали ранее разработанную ими технологию секвенирования РНК единичных клеток (scRNA-seq) для применения в бактериологии. Результаты опубликованы в журнале mBio.

Преимущества новой методики

Под руководством профессора Йорга Фогеля команда добилась значительных улучшений:

• Повышенная пропускная способность благодаря интеграции удобного и гибкого процесса автоматизации.
• Увеличенная надежность работы метода, что снизило частоту ошибок при считывании генетической информации.
• Больше информации об экспрессии генов в отдельных клетках при более низкой стоимости секвенирования.
• Возможность детекции коротких регуляторных малых РНК (sRNAs) на уровне единичной клетки, что ранее было невозможно.

Проблемы предыдущих подходов

До недавнего времени для изучения транскриптома бактерий использовалось массовое секвенирование РНК (RNA-seq), которое дает лишь усредненные значения по популяции клеток. Это не позволяет выявить фенотипическую гетерогенность — различия между отдельными бактериями внутри популяции, играющие ключевую роль в стратегиях выживания и быстрой адаптации.

Разработка scRNA-seq для бактерий шла медленнее, чем для эукариот, из-за ряда проблем:

• Меньший размер прокариотических клеток и, соответственно, меньше материала для анализа.
• Сложности с лизисом клеточной стенки.
• Проблемы с детекцией специфических бактериальных транскриптов.
• Высокий уровень потери клеток и плохая детекция коротких транскриптов (например, sRNAs).
• Ограниченное распознавание транскриптов (около 200 генов на клетку), что значительно ниже среднего бактериального транскриптома.

Успешная валидация на Salmonella

Улучшенная технология была успешно протестирована на бактериях типа Salmonella в различных условиях роста. Данные подтвердили:

• Повышение пропускной способности и надежности протокола при снижении потери клеток.
• Улучшение охвата генов и пределов их обнаружения.
• Наличие гетерогенности внутри одной клеточной популяции, которую нельзя было выявить с помощью усредненных значений прежних методов.
• Возможность анализа активности генов, важных для болезнетворных свойств бактерий.

Метод особенно подходит для экспериментов с ограниченным исходным материалом, например, для анализа небольших субпопуляций бактериальных клеток в нишах хозяина или внутриклеточных бактерий.