Новый метод значительно повышает эффективность РНК-интерференции (RNAi) для "выключения" генов

Учёные из Лаборатории в Колд-Спринг-Харбор (CSHL) разработали мощный метод, позволяющий просеивать тысячи кандидатных РНК-молекул в форме шпильки (shRNA) и выделять только те, которые эффективно подавляют активность целевого гена. Это достижение позволит в полной мере использовать РНК-интерференцию (RNAi) — естественный клеточный механизм, уже применяемый для поиска генов рака, борьбы с вирусными инфекциями и, в последнее время, в клинических испытаниях методов лечения болезней.

Одна из главных проблем RNAi — сложность поиска правильного молекулярного триггера. Для каждого гена, в зависимости от размера его кодирующей белок РНК, потенциально существует от 500 до 5000 различных малых РНК, способных запустить RNAi. Большинство из них — слабые триггеры, которые либо не полностью подавляют активность гена, либо воздействуют на другой ген (так называемые "побочные эффекты").

В статье в журнале Molecular Cell учёные объясняют, как решили эту проблему. Они создали анализ, который одновременно тестирует тысячи коротких шпилечных РНК (shRNA) на их способность "выключать" интересующие гены в клетках и идентифицирует наиболее мощные триггеры RNAi.

В пилотном эксперименте по поиску лучших триггеров для девяти генов (включая несколько трудно подавляемых генов рака) команда сгенерировала генетические коды для около 20 000 shRNA. Каждый код был вставлен в ретровирус, который также был сконструирован для переноса целевого гена ("сенсора") и гена флуоресцентного белка ("маркера"). Когда клетки заражались такими вирусами, в каждой клетке производились сенсор, маркер и одна shRNA.

• Неэффективные shRNA не запускали разрушение РНК целевого гена и маркера, поэтому клетки ярко флуоресцировали.
• Мощные shRNA-триггеры вызывали эффективное разрушение РНК целевого гена и маркера, поэтому клетки-хозяева не имели следов флуоресценции.

"Всё, что нам оставалось сделать, — это отсортировать эти клетки, извлечь генетический материал каждой и секвенировать короткую шпилечную РНК", — объясняют авторы. Это дало идентичность триггера RNAi, наиболее эффективного для подавления целевого гена.

Команда обнаружила, что для каждого из девяти генов только около 2,5% всех возможных shRNA против этого гена могли эффективно подавить его активность. Успех их подхода означает, что учёным, возможно, больше не придётся полагаться на текущие алгоритмы, которые часто неточно предсказывают, какая shRNA будет работать лучше всего.

Анализ 20 000 малых шпилечных РНК, особенно тех, которые были извлечены из клеток с эффективно "выключенным" геном, позволил получить новые данные о процессе биогенеза малых РНК и значительно улучшить рецепт создания мощного триггера RNAi. "Наш анализ дал нам прочную основу для рационального дизайна коротких шпилечных РНК", — заключают исследователи.