Новый метод изучения клеток печени в живом организме может раскрыть гены, необходимые для регенерации

Печень обладает легендарной способностью к регенерации. Даже если удалить более 70% органа, оставшаяся ткань может восстановить целую новую печень.

Кристин Наус, доцент биологии MIT, хочет выяснить, как печени это удаётся, чтобы научиться стимулировать регенерацию других органов. Её лаборатория разработала новый способ проведения полногеномных исследований печени у мышей с использованием системы редактирования генов CRISPR.

С помощью этой техники можно изучать, как каждый ген в геноме мыши влияет на конкретное заболевание или процесс. В статье, описывающей метод, исследователи обнаружили несколько генов, важных для выживания и пролиферации клеток печени, которые ранее не были замечены в исследованиях клеток, выращенных в чашке Петри.

"Если мы действительно хотим понять физиологию и болезни млекопитающих, мы должны изучать эти процессы в живом организме везде, где это возможно, потому что именно там мы можем исследовать биологию в её наиболее естественном контексте", — говорит Наус.

Наус — старший автор новой статьи, опубликованной в Cell Genomics.

Влияние внешней среды

Во время учёбы в MIT Наус использовала регенерирующую ткань печени для изучения деления клеток. Она заметила, что клетки, делящиеся в печени, ведут себя не так, как клетки печени, делящиеся в лабораторной чашке.

"Я поняла, насколько даже такой внутренний для клетки процесс, как деление, явно зависит от внеклеточной среды. Когда мы изучаем клетки в культуре, мы теряем влияние этого контекста", — говорит она.

Однако полногеномные скрининги, использующие CRISPR, сложно масштабировать до уровня целого организма. Хотя несколько групп использовали CRISPR для полногеномных скринингов в мозге и коже, эти исследования требовали большого количества мышей.

"Ограниченная экспериментальная управляемость моделей мышей долгое время мешала нам всесторонне изучать вопросы физиологии и болезней млекопитающих. Это то, что я действительно хотела изменить", — отмечает Наус.

Чтобы доставить направляющие РНК (guide RNA) в гепатоциты (основной тип клеток печени), Наус использовала лентивирус. Она вводила направляющие РНК новорождённым мышам, так что после интеграции в геном они передавались будущим поколениям клеток печени по мере роста мышей. В результате удалось добиться стабильной экспрессии направляющих РНК в десятках миллионов гепатоцитов, что достаточно для полногеномного скрининга всего на одном животном.

Жизнеспособность клеток

Для тестирования системы исследователи решили найти гены, влияющие на жизнеспособность гепатоцитов — их способность выживать и размножаться. Они доставили библиотеку из более чем 70 000 направляющих РНК, нацеленных на более чем 13 000 генов, а затем определили влияние каждого нокаута на жизнеспособность клеток.

Мыши были сконструированы так, что Cas9 можно было активировать в любой момент их жизни. Используя группу из четырёх мышей, исследователи включили экспрессию Cas9, когда мышам было пять дней. Три недели спустя они проанализировали клетки печени и измерили количество каждой направляющей РНК.

Если конкретная направляющая РНК была в изобилии, это означало, что ген, на который она нацелена, можно выключить без смертельного повреждения клеток. Если направляющая РНК не обнаруживалась, это означало, что нокаут этого гена был смертелен для клеток.

Этот скрининг выявил сотни генов, связанных с жизнеспособностью гепатоцитов, и результаты были очень последовательными у всех четырёх мышей. Исследователи также сравнили найденные гены с генами, связанными с заболеваниями печени у человека. Они обнаружили, что гены, мутировавшие при синдромах неонатальной печёночной недостаточности, также вызывали гибель гепатоцитов в их скрининге.

Скрининг также выявил критические гены жизнеспособности, которые не были идентифицированы в исследованиях клеток печени, выращенных в лаборатории. Многие из этих генов участвуют во взаимодействиях с иммунными клетками или с молекулами внеклеточного матрикса, окружающего клетки. Эти пути, вероятно, не проявлялись в скринингах культур клеток, потому что они связаны с взаимодействием клеток с внешней средой.

Сравнивая результаты самцов и самок, исследователи также выявили несколько генов, оказывающих полоспецифичное влияние на жизнеспособность, что было бы невозможно обнаружить, изучая только клетки.

Планы на будущее

Наус теперь планирует использовать эту систему для выявления генов, критически важных для регенерации печени.

"Многие ткани, такие как сердце, не могут регенерировать, потому что у них нет стволовых клеток, а дифференцированные клетки не могут делиться. Однако печень — это также высокодифференцированная ткань без стволовых клеток, но она сохраняет удивительную способность к регенерации после повреждения", — говорит она. — "Геном клеток печени ничем не отличается от генома клеток сердца. Все эти клетки имеют одно и то же руководство в своём ядре, но клетки печи явно читают другие предложения в этом руководстве, чтобы регенерировать. Мы не знаем, что это за предложения? Что это за гены? Если мы сможем их идентифицировать, возможно, когда-нибудь мы сможем заставить сердце регенерировать".

Эта новая методика скрининга также может быть использована для изучения таких состояний, как жировая болезнь печени и цирроз. Лаборатория Наус также работает над расширением этого подхода на другие органы, помимо печени.

"Нам нужно найти способы эффективной доставки направляющих РНК в другие ткани. Преодолев этот технический барьер, мы сможем добиться той же экспериментальной управляемости, которую теперь имеем в печени, для сердца или других тканей", — заключает она.