Прорыв в базовом редактировании расширяет возможности генной инженерии и эволюции признаков у арбуза

Цитозиновые и аденозиновые редакторы оснований (CBEs и ABEs) играют ключевую роль в молекулярной селекции, позволяя точно модифицировать однонуклеотидные полиморфизмы (SNPs) у растений, что критически важно для агрономических признаков и эволюции видов. Однако их применение ограничено лишь этими двумя типами замен оснований.

Новые разработки для клеток млекопитающих, такие как CGBE (C-to-G base editor), обещают расширить эти возможности. Но в растениях, особенно в таких культурах, как арбуз, где SNPs сильно влияют на эволюцию признаков, сохраняются проблемы с достижением высокой эффективности. Целью данного исследования стала разработка высокоэффективного CGBE, адаптированного для арбуза.

Статья "Developing a highly efficient CGBE base editor in watermelon" опубликована в журнале Horticulture Research.

Оптимизация редактора

В исследовании использовали двухэтапный процесс для создания CGBE, интегрирующего деаминазу человеческого APOBEC3A (hA3A) и урацил-ДНК-гликозилазу Arabidopsis (UNG). Сначала были созданы hA3A-CBEs для индукции замен C-to-G наряду с редактированием C-to-T. Тестировались различные промоторы (AtUbi, 2×35S, AtRps5a) для экспрессии белка hA3A-nCas9 (D10A)-UGI.

Трансгенные растения арбуза получали с использованием четырех sgRNA, нацеленных на три гена: ClALS1, ClDA1 и ClEOD1. Результаты показали, что CBEs на основе промоторов AtUbi и 2×35S достигли высокой эффективности редактирования C-to-T (27.0% и 93.4% соответственно). В некоторых образцах также наблюдались трансверсии C-to-G, вероятно, из-за распознавания и вырезания мутаций C-to-U эндогенной UNG.

Создание эффективного CGBE

Чтобы улучшить применимость техник базового редактирования в арбузе, исследователи разработали эффективный редактор SCGBE2.0. Для этого из стандартного hA3A-CBE удалили ингибитор урацил-гликозилазы (UGI) и добавили компонент урацил-ДНК-гликозилазы (UNG).

Результаты и перспективы

Результаты, полученные на стабильно трансформированных растениях арбуза, показали, что SCGBE2.0 эффективно индуцировал:

• C-G мутации в позициях C5-C9 у 43.2% трансгенных растений (максимальная эффективность конверсии оснований — 46.1%).
• C-A мутации в позиции C4 у 23.5% трансгенных растений (максимальная эффективность — 45.9%).

Этот редактор предпочитает PAM-последовательности NGG и NAG, что расширяет возможности для сайт-предпочтительных конверсий C-to-G/A в арбузе. Для будущих оптимизаций SCGBE2.0 следует сосредоточиться на сужении окна редактирования и снижении образования делеций/вставок (indels) для повышения точности.

Вывод

Новая система редактирования достигла эффективных мутаций C-to-G/A в арбузе, предоставив инструмент для точной модификации оснований и сайт-направленного насыщающего мутагенеза. Этот прорыв в разработке CGBE не только расширяет возможности молекулярной селекции арбуза, но и открывает новые пути для исследований других двудольных растений.