Повышение эффективности редактирования генома для модификации изначально недоступных последовательностей ДНК
Исследователи из Центра изучения организмов Гейдельбергского университета существенно повысили эффективность методов молекулярной генетики, таких как CRISPR/Cas9 и родственные системы, и расширили области их применения.
Вместе с коллегами ученые оптимизировали эти инструменты, чтобы, среди прочего, обеспечить эффективный генетический скрининг для моделирования конкретных мутаций. Кроме того, теперь можно модифицировать изначально недоступные последовательности ДНК. По словам профессора Йоахима Виттбродта, это открывает новые возможности для фундаментальных исследований и потенциальной терапии.
Улучшение доставки в ядро клетки
Проблема при использовании CRISPR/Cas9 — эффективная доставка ферментов Cas9 в ядро. Клетка имеет сложный механизм контроля доступа. Ученые создали универсальный «VIP-пропуск» — короткий пептидный «тег высокой эффективности» (high efficiency-tag, hei-tag). Белки, включая Cas9, оснащенные этим тегом, проникают в ядро значительно быстрее.
В сотрудничестве с фармакологами команда показала, что Cas9 с hei-tag обеспечивает высокоэффективное редактирование генома не только в модельном организме японской рыбке медаке (Oryzias latipes), но и в культурах клеток млекопитающих и эмбрионах мыши.
Базовые редакторы для генетического скрининга in vivo
В другом исследовании ученые доказали, что базовые редакторы (base editors) эффективно работают в живом организме и подходят для генетического скрининга. На примере рыбки медаки они показали, что точечные модификации отдельных нуклеотидов ДНК дают результат, сравнимый с трудоемким выведением организмов с измененными генами.
Совместно с детским кардиологом доктором Якобом Гиртеном команда сфокусировалась на мутациях, предположительно вызывающих врожденные пороки сердца у человека. Моделируя эти мутации в геноме рыб, ученые воспроизвели и изучили эмбрионы с аналогичными дефектами сердца. Целенаправленное вмешательство привело к видимым изменениям уже на ранних стадиях развития, что подтвердило причинно-следственную связь между генетическим изменением и симптомами.
Для точного вмешательства была разработана онлайн-программа ACEofBASEs, которая помогает идентифицировать генетические мишени для эффективного изменения целевых генов и белков. Рыбка медака оказалась отличной моделью для такого скрининга, что может стать отправной точкой для разработки индивидуализированного лечения.
Преодоление ограничений базовых редакторов
Базовые редакторы могут связываться с ДНК только при наличии определенной последовательности-мотива (Protospacer Adjacent Motif, PAM). Если этого мотива нет рядом с редактируемым нуклеотидом, изменение невозможно.
Команда под руководством доктора Томаса Тумбергера нашла способ обойти это ограничение, используя два базовых редактора в одной клетке последовательно. На первом этапе один редактор создает новый мотив PAM, что позволяет второму редактору, применяемому одновременно, отредактировать ранее недоступный сайт.
Этот ступенчатый метод оказался высокоэффективным и позволил увеличить количество потенциальных мишеней для стандартных базовых редакторов на 65%. Теперь можно модифицировать и те последовательности ДНК, которые были изначально недоступны.
Оптимизация существующих инструментов редактирования генома открывает широкие возможности для фундаментальных исследований и потенциально новых терапевтических подходов.
Результаты исследований опубликованы в журналах eLife и Development.