Новые стратегии и инструменты для редактирования генома
Биоинженеры Университета Райса представили новые методы прецизионного редактирования генома, которые более точны и имеют меньше ошибок по нецелевым сайтам (off-target).
Новые стратегии изложены в трёх статьях специального выпуска журнала Nature Molecular Therapy, посвящённого улучшению революционной технологии редактирования генома CRISPR-Cas9.
Профессор биоинженерии Ганг Бао и его коллеги предлагают идеи для максимизации точного редактирования генов с помощью «инженерных нуклеаз» — биологических катализаторов, способных разрезать ДНК. CRISPR-Cas9, естественная защитная система бактерий, позволяет исследователям направлять белок Cas9 к определённому участку генетического кода в клетке для его разрезания, нарушения или замены.
Однако CRISPR-Cas9 всё ещё может ошибочно разрезать нецелевые последовательности, что в терапевтических применениях может привести к негативным последствиям, включая рак. Цель исследований — усовершенствовать технологию, которую Бао описывает как «наноножницы для редактирования генов».
Исследование альтернативных систем Cas9
В двух статьях исследователи изучают разные ортологи Cas9 — белки из видов бактерий, отличных от обычно используемой Streptococcus pyogenes (Spy).
Система из Neisseria meningitidis (Nme). Её ключевое отличие — более длинная последовательность PAM (protospacer-adjacent motif), необходимая для связывания Cas9 с ДНК. У SpyCas9 PAM обычно состоит из трёх нуклеотидов, а у Nme — из восьми. Это означает, что Nme может найти меньше мишеней, но с большей вероятностью это будут правильные мишени, что потенциально делает её более безопасной альтернативой.
Система из Streptococcus thermophilus (Sth) (в сотрудничестве с Университетом Фрайбурга, Германия). Белки Sth также распознают более длинные PAM. Тесты на человеческих клетках показали, что Sth с более строгими требованиями к PAM значительно лучше избегают off-target-эффектов, чем SpyCas9.
Важным открытием стало то, что Cas9 может разрезать ДНК даже при наличии «выпуклостей» (bulges) — когда целевая последовательность на один нуклеотид длиннее или короче, чем ожидает направляющая РНК. На основе этого создан веб-инструмент для поиска потенциальных нецелевых сайтов, содержащих несовпадения оснований, РНК- и ДНК-выпуклости.
Ещё одно преимущество Nme и Sth Cas9 — их меньший размер, позволяющий упаковывать их в адено-ассоциированный вирус для доставки и лечения конкретных клеток в организме.
Пути решения проблемы off-target-эффектов
Третья статья представляет собой обзор современных методов CRISPR-Cas9, фокусируясь на инструментах для выбора мишени, экспериментальных методах и валидации. В ней также перечислены нерешённые задачи для полного устранения off-target-эффектов.
Бао отмечает, что, в отличие от более старых технологий вроде TALEN и цинковых пальцев, CRISPR-Cas9 достаточно проста для освоения и использования студентами в короткие сроки. Он надеется сделать свою лабораторию центром компетенций по редактированию генома в Техасском медицинском центре (TMC) и стимулировать создание консорциума лабораторий TMC, работающих с CRISPR, для совместного решения общих проблем.