Улучшение полногеномного секвенирования единичных бактериальных клеток с помощью модифицированной полимеразы
Секвенирование генома единичных бактериальных клеток долгое время было технически сложной задачей из-за, казалось бы, неустранимого смещения (биаса) на стадии амплификации ДНК, что затрудняло получение высококачественной последовательности генома из одной клетки.
Новый метод, разработанный исследователями из Центра по изучению единичных клеток (Single-Cell Center) Циндаоского института биоэнергетики и биопроцессных технологий (QIBEBT) Китайской академии наук (CAS), значительно снижает этот биас, открывая новые горизонты для исследований единичных клеток. Исследование было опубликовано в журнале Frontiers in Bioengineering and Biotechnology 29 июня.
При использовании традиционных методов секвенирования генов обычно используются миллионы клеток одновременно. Однако такое массовое секвенирование неизбежно нивелирует различия между клетками, затрудняя изучение взаимосвязей между различными клеточными линиями или другие исследования, требующие рассмотрения единичной клетки. Эти технологические проблемы особенно серьезны для бактерий, поскольку бактериальная клетка настолько мала, что содержание в ней ДНК на несколько порядков ниже, чем в клетке человека или животного.
Для секвенирования генов или целых геномов ДНК сначала необходимо «амплифицировать». Амплификация генов, иногда называемая «молекулярным фотокопированием», позволяет получить миллионы или даже миллиарды копий сегментов ДНК.
Амплификация не вызывает проблем при массовом секвенировании генов. Однако при амплификации ДНК единичной бактериальной клетки, особенно целых геномов, количество доступной для копирования ДНК очень ограничено, и процесс амплификации может вносить смещения, которые приводят к перепредставленности или недопредставленности различных участков генома.
«Снижение амплификационного биаса было чем-то вроде святого Грааля для исследователей амплификации геномов единичных клеток, — сказал Чжан Цзя, биотехнолог из QIBEBT и ведущий автор статьи. — И мы думаем, что нашли способ решить эту проблему».
Исследователи разработали метод под названием «Улучшенная амплификация генома единичной клетки» (Improved Single-cell Genome Amplification, iSGA). Он в основном включает белковую инженерию, а также технологическую оптимизацию для повышения амплификационной способности ДНК-полимеразы phi29. ДНК-полимераза phi29 обычно используется в полногеномной амплификации единичных клеток, но страдает от проблем низкого покрытия генома и низкой эффективности.
«Разработанная нами ДНК-полимераза phi29 для iSGA более чем в два раза эффективнее и стабильнее, чем обычная phi29 ДНК-полимераза, — сказал Чжан Цзя. — Она также почти в одиннадцать раз дешевле основной широко доступной коммерческой версии».
Исследователи достигли этого, модифицировав полимеразу для повышения ее амплификационной способности. Используя метод компартментализованной саморепликации (compartmentalized self-replication, CSR) для эволюции ДНК-полимеразы phi29, они изменили ее структуру, чтобы повысить активность, специфичность и стабильность. «Новая ДНК-полимераза, которую мы назвали HotJa Phi29 DNA polymerase, демонстрирует значительно лучшее покрытие генома (99,75%) при более высокой температуре (40℃) по сравнению с существующими коммерческими полимеразами», — сказал один из старших авторов, профессор Сюй Цзянь из Центра по изучению единичных клеток QIBEBT.
Они также оптимизировали условия амплификационной реакции и модифицировали амплификационный буфер (раствор, обеспечивающий подходящую химическую среду для ДНК-полимеразы), чтобы улучшить стабильность и активность phi29 ДНК-полимеразы. Кроме того, исследователи разработали более эффективный метод деконтаминации для снижения загрязнения в процессе амплификации.
Теперь исследователи планируют оптимизировать свой метод iSGA и полимеразу HotJa Phi29 для различных применений и типов образцов, а также еще больше снизить затраты. Команда разработала серию приборов, включая RACS-Seq, FlowRACS и EasySort, для функциональной сортировки микробных единичных клеток. Их цель, посредством разработки этих приборов и реагентов, — позволить микробиологам сортировать и секвенировать любые индивидуальные микробные клетки на Земле, не беспокоясь о качестве данных или стоимости реагентов.