Метод мутагенеза повышает эффективность рубиско — ключевого фермента фотосинтеза
Фермент рубиско катализирует ключевую реакцию фотосинтеза — включение диоксида углерода в органические соединения для создания сахаров. Однако рубиско, считающийся самым распространённым ферментом на Земле, очень неэффективен по сравнению с другими ферментами фотосинтеза.
Химики MIT показали, что могут значительно улучшить версию рубиско, обнаруженную у бактерий из среды с низким содержанием кислорода. Используя метод направленной эволюции, они выявили мутации, способные повысить каталитическую эффективность рубиско до 25%.
Исследователи планируют применить свою технику к формам рубиско, которые можно использовать в растениях для повышения скорости фотосинтеза, что потенциально может увеличить урожайность сельскохозяйственных культур.
"Это, на мой взгляд, убедительная демонстрация успешного улучшения ферментативных свойств рубиско, дающая большую надежду на инженерию других его форм", — говорит Мэтью Шоулдерс, профессор химии MIT.
Шоулдерс и Роберт Уилсон, научный сотрудник кафедры химии, являются старшими авторами нового исследования, опубликованного в Proceedings of the National Academy of Sciences. Ведущий автор статьи — аспирант MIT Джули Макдональд.
Эволюция эффективности
Рубиско катализирует первую реакцию в цепи превращений рибулозобисфосфата в глюкозу — карбоксилирование, при котором углерод из CO2 добавляется к рибулозобисфосфату.
По сравнению с другими ферментами фотосинтеза рубиско очень медленный, катализируя всего от 1 до 10 реакций в секунду. Кроме того, рубиско может взаимодействовать с кислородом, что приводит к конкурирующей реакции оксигенации, которая тратит часть энергии, поглощённой из солнечного света.
"Для белковых инженеров это действительно привлекательный набор проблем, потому что эти черты кажутся вещами, которые, надеюсь, можно улучшить, внося изменения в аминокислотную последовательность фермента", — говорит Макдональд.
Большинство предыдущих исследований использовали направленную эволюцию, но с помощью метода error-prone PCR, который обычно вводит только одну или две мутации в целевой ген. Ограничения этого подхода и необходимость ручных шагов отбора замедляли процесс.
Команда MIT вместо этого использовала более новую технику мутагенеза MutaT7, ранее разработанную в лаборатории Шоулдерса. Этот метод позволяет проводить и мутагенез, и скрининг в живых клетках, что значительно ускоряет процесс и позволяет мутировать целевой ген с более высокой частотой.
"Наша техника непрерывной направленной эволюции позволяет изучить гораздо больше мутаций в ферменте, чем это делалось в прошлом", — отмечает Макдональд.
Улучшенное рубиско
Для исследования учёные начали с версии рубиско, выделенной из семейства полуанаэробных бактерий Gallionellaceae, которая является одной из самых быстрых в природе. Во время экспериментов по направленной эволюции в E. coli бактерии содержались в среде с атмосферным уровнем кислорода, создавая эволюционное давление для адаптации к нему.
После шести раундов направленной эволюции исследователи идентифицировали три различные мутации, которые повысили устойчивость рубиско к кислороду. Каждая из этих мутаций расположена рядом с активным центром фермента. Учёты полагают, что эти мутации улучшают способность фермента предпочтительно взаимодействовать с диоксидом углерода, а не с кислородом, что приводит к общему увеличению эффективности карбоксилирования.
"Основной вопрос здесь: можно ли изменить и улучшить кинетические свойства рубиско, чтобы он лучше работал в средах, где вы хотите, чтобы он работал лучше?" — говорит Шоулдерс. "В процессе направленной эволюции изменилось то, что рубиско стал меньше "хотеть" реагировать с кислородом. Это позволяет этому рубиско хорошо функционировать в богатой кислородом среде, где обычно он постоянно отвлекался бы и реагировал с кислородом, чего вам не нужно".
В текущей работе исследователи применяют этот подход к другим формам рубиско, включая рубиско растений. Считается, что растения теряют около 30% энергии от поглощённого солнечного света в процессе фотодыхания, которое происходит, когда рубиско действует на кислород вместо диоксида углерода.
"Это действительно открывает двери для множества захватывающих новых исследований и является шагом за пределы типов инженерии, которые доминировали в прошлом", — говорит Уилсон. "Определённо существуют преимущества для сельскохозяйственной продуктивности, которые можно использовать с помощью лучшего рубиско".