Первый высокомасштабируемый метод для мониторинга уровней и локализации белков

Исследователи из CeMM (Исследовательского центра молекулярной медицины Австрийской академии наук) разработали высокомасштабируемый метод, позволяющий одновременно изучать сотни белков, чтобы отслеживать изменения их уровней и локализации в клетке. Ранее учёные обычно изучали изменения белков, используя флуоресцентную метку для маркировки и наблюдения только за одним белком за раз. Новый подход вносит значительный вклад как в разработку лекарств (например, для лечения рака), так и в общее понимание динамики протеома. Результаты опубликованы в журнале Genome Research.

Белки регулируют важные аспекты клеточных процессов, и их уровни и локализация могут стать мишенями для лекарственной терапии. Например, на обилие белков можно влиять терапевтически с помощью препаратов, воздействующих на их производство и деградацию в клетке.

Традиционный метод с использованием зелёного флуоресцентного белка (GFP) позволял изучать множество воздействий (например, разные дозы препаратов) для одного белка, но не был пригоден для непредвзятого изучения таких воздействий на весь протеом в конкретный момент времени с высокой масштабируемостью.

Новый метод преодолевает узкое место в CRISPR-Cas9-интронном мечении, позволяя осветить не один белок, а значительную часть протеома. Учёные создали пулы клеток, содержащие сотни меченых белков, где в каждой клетке разный белок был помечен GFP. Эти пулы клеток подвергли воздействию PROTAC-деградатора BRD4 — транскрипционного регулятора, играющего ключевую роль в эмбриогенезе и развитии рака.

С помощью микроскопии в режиме реального времени исследователи наблюдали изменения в уровнях или внутриклеточной локализации любого из меченых белков в ответ на лечение. Стратегия CRISPR-Cas9-мечения позволила идентифицировать, какие именно белки изменили локализацию, с помощью in situ секвенирования всего пула клеток.

Это подтвердило известные мишени препарата, но также выявило неожиданные изменения. В частности, для воздействий на сигнализацию BRD4 метод обнаружил изменения в локализации шести белков, которые ранее не были распознаны другими методами высокопроизводительного скрининга. Метод также показал ожидаемые и новые изменения локализации белков в ответ на лечение одобренным противораковым препаратом метотрексатом.

Как объясняет руководитель группы Stefan Kubicek, эта технология впервые применяет интронное мечение к пулу генов и оптимизирована на всех трёх этапах — интронное мечение, клеточная визуализация и in situ секвенирование. Метод, применённый к химическим библиотекам, особенно мощён для разработки и глубокой характеристики лекарств, включая индукцию и ингибирование белок-белковых взаимодействий и химическую деградацию. Эта стратегия может ускорить открытие лекарств и оказать большое влияние на изучение глобальной и субклеточной динамики протеома.