Улучшение точности молекулярного количественного определения при высокопроизводительном секвенировании
Исследователи из NDORMS разработали новый подход, значительно повышающий точность РНК-секвенирования. Они определили основной источник неточного количественного определения как в коротко-, так и в длинночтении РНК и ввели концепцию коррекции ошибок по принципу «большинства голосов», что привело к существенному улучшению подсчёта молекул РНК.
Точное секвенирование генетического материала критически важно в современной биологии, особенно для понимания и лечения заболеваний, связанных с генетическими аномалиями. Однако текущие методы сталкиваются со значительными ограничениями.
В ключевом исследовании международный консорциум учёных под руководством Адама Криббса, адъюнкт-профессора вычислительной биологии, и Цзяньфэна Суня, постдокторанта Института Ботнара Оксфордского университета, разработал инновационный метод коррекции ошибок в ПЦР-амплификации — широко используемой технике в высокопроизводительном секвенировании.
Определив артефакты ПЦР как основной источник неточного количественного определения, исследователи решают давнюю проблему получения точных абсолютных подсчётов молекул РНК, что критически важно для различных приложений в геномных исследованиях. Исследование опубликовано в журнале Nature Methods.
Учёные сосредоточились на уникальных молекулярных идентификаторах (UMI) — случайных олигонуклеотидных последовательностях, используемых для устранения смещений, вносимых во время ПЦР-амплификации. Хотя UMI широко применяются в методах секвенирования, исследование показывает, что ошибки ПЦР могут подрывать точность молекулярного количественного определения, особенно на разных платформах секвенирования.
Цзяньфэн объяснил: «ПЦР-амплификация, необходимая для большинства методов РНК-секвенирования, может вносить ошибки, ставя под угрозу целостность данных. Мы решили эту проблему, синтезировав UMI-штрихкоды с использованием гомотримерных нуклеотидных блоков, что улучшило коррекцию ошибок и позволило проводить почти абсолютное количественное определение молекул РНК, значительно повысив точность молекулярного подсчёта».
Гомотримеры — это нуклеотидные последовательности, состоящие из трёх идентичных оснований, например, AAA, CCC, GGG. Оценивая сходство нуклеотидов в гомотримерах, ошибки обнаруживаются и исправляются методом «большинства голосов».
Исследование демонстрирует, что гомотримерные UMI значительно превосходят традиционные мономерные UMI в снижении ложноположительного обогащения при анализе дифференциально экспрессируемых генов и транскриптов (DEG и DET). Это улучшение жизненно важно для точной идентификации и количественного определения DEG или DET, особенно в подходах к секвенированию суммарной РНК (bulk sequencing).
Кроме того, в одноклеточном секвенировании, где часто требуется обширная ПЦР-амплификация, гомотримерные UMI доказали свою эффективность в смягчении эффектов ПЦР-артефактов, тем самым существенно повышая надёжность данных секвенирования.
«Конструируя UMI из гомогенных блоков нуклеозидов, мы стремились улучшить коррекцию ошибок как в коротко-, так и в длинночтении, демонстрируя нашу приверженность совершенствованию приложений технологии секвенирования», — говорит адъюнкт-профессор Адам Криббс, старший автор статьи и руководитель группы вычислительной биологии.
Это исследование имеет глубокие последствия. Исправляя ошибки ПЦР в UMI, оно значительно повышает точность молекулярного количественного определения в различных приложениях секвенирования. Это важный инструмент для исследователей в областях секвенирования суммарной РНК, одноклеточной РНК и ДНК, позволяющий проводить точный анализ экспрессии генов и молекулярных профилей.
Улучшенная коррекция ошибок UMI не только снижает частоту ложноположительных результатов, но и предлагает множество диагностических применений, особенно в сценариях, требующих продольного анализа образцов.