Биологи предупреждают о потенциальных ошибках в методе сверхэкспрессии микроРНК

Исследователи под руководством Александра Тоневицкого, декана факультета биологии и биотехнологии НИУ ВШЭ, обнаружили ранее упущенные особенности в методе сверхэкспрессии микроРНК. Учёные выяснили, что в некоторых случаях результаты экспериментов с этим методом могут быть неверными, а ошибки трудно обнаружить. Результаты опубликованы в журнале Biochimica et Biophysica Acta (BBA)—Gene Regulatory Mechanisms.

МикроРНК (miRNAs) — это небольшие молекулы РНК длиной около 20–25 нуклеотидов. Они регулируют экспрессию генов, связываясь с молекулами матричной РНК (mRNA) и останавливая синтез белка.

• Суть проблемы: Распространённый метод сверхэкспрессии микроРНК предполагает введение в клетки молекулы-предшественника, которую фермент Dicer должен разрезать, чтобы получить нужную микроРНК. Оказалось, что Dicer действует как молекулярная линейка, отмеряя ~22 нуклеотида.
• Причина ошибки: При синтезе предшественника к его концу часто добавляются один или несколько урацилов (U). Если исходная последовательность микроРНК длиннее 19 нуклеотидов, эти добавленные урацилы сдвигают точку разреза Dicer. В результате образуются изоформы микроРНК с другой последовательностью.
• Экспериментальное подтверждение: Учёные проверили это на примере микроРНК miR-93-5p (23 нуклеотида), уровень которой повышен при агрессивном раке простаты. Секвенирование показало, что добавленные урацилы вызывают сдвиг в позиции разреза.
• Последствия: Образовавшиеся изоформы miR-93-5p подавляли экспрессию гена HMGA1, хотя стандартная форма miR-93-5p не нацелена на этот ген. Это может привести к неверным выводам о молекулярных механизмах при изучении болезней.
• Проблема контроля: Стандартный метод проверки — ПЦР (PCR) — в данном случае недостаточно чувствителен. Обнаружить сдвиг можно только с помощью секвенирования, которое дорого и не всегда доступно.

«Изоформы могут нацеливаться не на те молекулы mRNA, которые предполагались в эксперименте, что ведёт к подавлению не тех генов. Понимание этой особенности критически важно как для фундаментальных исследований, так и для медицинских приложений», — отмечает Диана Мальцева, заведующая Международной лабораторией микрофизиологических систем НИУ ВШЭ.

Учёные подчёркивают важность разработки новых методов сверхэкспрессии микроРНК и тщательного планирования экспериментов.