Изучение транспортных белков на уровне одной молекулы
Транспортеры, подобно лодкам, перевозящим пассажиров через реку, перемещают вещества через клеточные мембраны. Этот процесс фундаментален для здорового функционирования клеток у всех форм жизни, от бактерий до человека. Ранее функцию этих транспортеров можно было изучать лишь по поведению сотен или тысяч белков одновременно. Опубликованная сегодня в Nature работа описывает новые методы, позволяющие изучать один транспортер за раз.
Этот мощный прорыв можно представить, если попытаться понять местоположение, скорость и пассажиров конкретной лодки, имея только общую статистику по всему флоту.
«Наблюдая за активностью отдельных молекул, мы прояснили часть механизма работы транспортера, что может оказаться критически важным для будущих исследований многих клинически значимых белков этого семейства», — сказал соавтор Скотт Бланшар, Ph.D., сотрудник Департамента структурной биологии St. Jude.
Техника открывает новые возможности
Исследование опиралось на метод одномолекулярного флуоресцентного резонансного переноса энергии (smFRET). Этот метод позволяет получать точные измерения активности отдельных транспортеров. Эта передовая техника — мощный инструмент для изучения механизмов действия, а также мутаций, связанных с заболеваниями. Она доступна лишь в нескольких лабораториях мира.
Предыдущие одномолекулярные методы позволяли измерять активность так называемых «ионных каналов», которые обеспечивают быстрый перенос заряженных частиц через мембраны.
Эти методы произвели революцию в понимании каналов, но не подходили для транспортеров из-за большого разнообразия переносимых веществ и их относительно низкой скорости транспорта. Новые методы smFRET более применимы для широкого спектра транспортеров.
Работа транспортеров, шаг за шагом
Нейротрансмиттерные натрий-симпортеры (NSS) — это семейство транспортных белков, наиболее известных в мозге, которые перемещают молекулы в клетку и из нее. У человека NSS для нейромедиаторов серотонина и норадреналина являются мишенями почти для всех антидепрессантов. NSS для дофамина — ключевые мишени для амфетамина и кокаина. Понимание этого класса белков и их функционирования даст новые представления о механизмах действия этих терапевтических и наркотических веществ и о том, как можно улучшить терапию, нацеленную на эти транспортеры.
Исследователи применили smFRET для изучения бактериального родственника белков NSS — транспортера MhsT, который переносит аминокислоты через клеточную мембрану. Команда хотела понять самую медленную часть транспортного процесса, называемую лимитирующей стадией. Ученые с удивлением обнаружили, что лимитирующая стадия для транспортера MhsT различается для разного «груза».
Чтобы переместить молекулу через мембрану, транспортер меняет свою форму — как для захвата вещества снаружи клетки, так и для его высвобождения внутри. Исследователи выяснили, что самой медленной частью цикла является процесс возврата к форме, ориентированной наружу, причем считалось, что транспортер в этот момент пуст для одних типов груза, но не для других.
«Поскольку для разного груза самые медленные стадии разные, полученные данные указывают на то, что стадия "возврата" происходит не с пустым транспортером. Это согласуется с другими доказательствами существования вторичного сайта связывания на транспортном белке, который играет ключевую роль в регуляции его активности», — сказал соавтор Джонатан Джавич, M.D., Ph.D., из Колумбийского университета и Нью-Йоркского государственного психиатрического института.
Более глубокое понимание функциональной значимости этого второго сайта связывания в семействе белков NSS будет иметь критическое значение для изучения фармакологии и эффективности лекарств, нацеленных на эти транспортеры.