Новый метод расширяет возможности изучения функций микробных генов

Исследователи из Университета Делавэра разработали новую технику для изучения функций бактериальных генов, описанную в статье в Nature Communications от 6 мая. Метод позволяет эффективнее исследовать обширный мир микробов.

Команда из лаборатории Элефтериоса Папуцакиса создала специально сконструированные бактерии E. coli, которые могут принимать, распознавать и реагировать на гены множества других видов бактерий. Ведущие авторы — Николас Сандовал и Стефан Гайда.

Микробы — источник новых химических соединений и биологических функций (производство лекарств, преобразование растительных волокон в топливо, нейтрализация разливов нефти). Однако большинство микроорганизмов невозможно культивировать в лаборатории, что ограничивает их изучение.

Функция до идентификации

Ученые обходят эту проблему, создавая «метагеномные библиотеки». ДНК (метагеном) извлекается, например, из образца почвы, получая случайные фрагменты генетического материала от многих организмов. Каждый фрагмент вставляется в бактерию E. coli.

Функциональный скрининг позволяет искать новые белки или клеточные активности, не определяя заранее конкретный ген или даже вид организма. Однако E. coli часто плохо распознает промоторы — участки ДНК, указывающие, где начинать транскрипцию чужеродных генов.

«Цель этой работы — создать бактерии, способные лучше экспрессировать большее разнообразие генов из метагенома, чтобы при скрининге получать более широкое представление о реальной генетической популяции», — говорит Сандовал.

Открытие: E. coli учится распознавать чужеродные промоторы

Транскрипционный аппарат клетки включает сигма-фактор — белок, помогающий распознавать промоторы. Исследователи обнаружили, что если сконструировать E. coli для производства сигма-фактора RpoD из микроба Lactobacillus plantarum (Lpl), это позволяет E. coli распознавать промоторы из любого источника.

Был создан штамм бактерий, способный транскрибировать любой фрагмент чужеродной ДНК, все еще связанный с промотором.

Зеленый свет для проверки

Для проверки эффективности разных сигма-факторов Гайда предложил элегантный метод. Каждый чужеродный фрагмент ДНК помещался в вектор, куда также был вставлен ген зеленого флуоресцентного белка (gfp). Если E. coli распознавала и транскрибировала чужеродный ген, она также транскрибировала gfp и производила GFP, светящийся зеленым под ультрафиолетом.

С помощью проточной цитометрии можно было подсчитать количество светящихся клеток, чтобы определить, сколько фрагментов было успешно транскрибировано.

Результаты

E. coli с сигма-фактором Lpl транскрибировала до 39 раз больше чужеродных генетических фрагментов, чем обычные клетки E. coli, при тестировании на геномных библиотеках нескольких видов.

• При тесте с настоящей метагеномной библиотекой (из образца почвы) новый штамм показал в 10 раз больше светящихся клеток по сравнению с контролем.

«Было удивительно и фантастично, что сигма-фактор Lpl работал с каждой протестированной библиотекой и чрезвычайно хорошо — с метагеномной. Мы нашли очень надежное и эффективное решение», — говорит Сандовал.

Новый штамм E. coli является предметом ожидающего патента. По словам Папуцакиса, он найдет широкое применение: от фундаментальной биологии и экологии до биотехнологии и биомедицины — для создания клеток, производящих сложные молекулы-предшественники фармацевтических препаратов, или для биоремедиации.

«Надеюсь, эта работа значительно повысит возможность проведения функциональных скринингов метагенома и позволит всем, кто их выполняет, искать интересные применения для здоровья и промышленности гораздо эффективнее и проще», — заключает Сандовал.