Новый репортер на основе люциферазы светлячка выявляет проблемы синтеза белков в эндоплазматическом ретикулуме
Исследователи из Science Tokyo разработали репортерную систему на основе люциферазы светлячка (FLuc), способную обнаруживать нарушения в транспорте белков в эндоплазматический ретикулум (ЭР) и в формировании дисульфидных связей. Инструмент, вдохновленный природными механизмами бактерий, предлагает простой и надежный метод для изучения этих ключевых процессов, связанных с рядом заболеваний.
Контекст и проблема
В эукариотических клетках около трети всех белков человека должны транспортироваться в ЭР для правильного сворачивания и модификаций, включая образование дисульфидных (S–S) связей. Сбои в этих процессах лежат в основе многих болезней, но существующие методы их изучения ограничены, сложны или требуют дорогостоящего оборудования.
Принцип работы репортера
- Конструкция: Ученые создали вариант FLuc, который инактивируется при образовании дисульфидных связей в ЭР, но остается активным в цитозоле или если связи не образуются.
- Нацеливание: Белок модифицирован для направленного транспорта в ЭР.
- Чувствительность: В последовательность FLuc стратегически введены остатки цистеина, делающие фермент склонным к неправильному сворачиванию (и деактивации) внутри ЭР.
- Детекция: Проблемы с транслокацией в ЭР или формированием дисульфидных связей приводят к аномально высокой активности люциферазы, которую легко измерить по свечению в реакции с D-люциферином в присутствии O2, АТФ и ионов Mg2+.
- Контроль и уточнение: Внутренний контроль на основе другого фермента биолюминесценции обеспечивает точность измерений. Наличие мотива для гликозилирования только при попадании в ЭР позволяет определить, что именно — сбой транспорта или нарушение образования дисульфидных связей — вызвало активацию репортера.
Демонстрация возможностей
- Система успешно выявляла нарушения, вызванные химическим изменением редокс-среды ЭР.
- Репортер детектировал дефекты транслокации белков, индуцированные потенциальным препаратом против ВИЧ, сигнализируя об успешном ингибировании вируса.
Преимущества и перспективы
По словам авторов, репортер отличается простотой, устойчивостью к колебаниям условий и высокой воспроизводимостью. Ассays на основе люциферазы хорошо подходят для высокопроизводительного скрининга.
«Мы полагаем, что этот подход облегчит масштабный скрининг малых молекул, специфично блокирующих биосинтез вредных белков секреторного пути», — говорит Хироши Кадокура.
«Наша репортерная система станет ценным инструментом в различных областях, связанных с белками секреторного пути, выходя за рамки фундаментальных исследований», — добавляет Хидэки Тагучи.
Исследование опубликовано в журнале iScience.