Костная тканевая инженерия — полимерные мембраны с «нано-клеем» для эффективной регенерации кости
В новом исследовании, опубликованном в NPG Asia Materials, биоинженеры сообщили о разработке новой волокнистой мембраны со стволовыми клетками для восстановления костных дефектов в черепах мышей. Для этого они использовали вдохновлённый мидиями полидофамин (PDA) в качестве перспективного соединения для закрепления биологических веществ на поверхности мембраны, подобно адгезивным белкам мидий. В работе команда под руководством И Дэна из междисциплинарных отделов химической инженерии, машиностроения, технологии материалов, Центра перспективных материалов и регенеративной медицины в Китае и Австралии покрыла биосовместимые мембраны наночастицами полидофамина, чтобы создать множество топологических участков для прикрепления кальция и восстановления костных дефектов.
Команда инкубировала непокрытые и покрытые мембраны со стволовыми клетками, выделенными из костного мозга, и имплантировала мембраны для регенерации дефектов кости черепа у живых мышей. После 2-месячного трансляционного исследования они показали, что «липкие» мембраны направляют стволовые клетки на выработку значительно большего количества костной ткани по сравнению с непокрытыми мембранами.
Этап 1: Создание мембран PCL с включением PDA (PDA/PCL) методом электроспиннинга
Учёные использовали химию катехола для изготовления и синтеза волокнистых мембран PDA/PCL. Они равномерно диспергировали наночастицы (NPs) PDA в PCL с помощью непрерывной сонокации и встряхивания, а затем сформировали волокнистые мембраны методом электроспиннинга. Наблюдения с помощью сканирующего электронного микроскопа (SEM) показали, что чистые электроспун-мембраны PCL оставались гладкими, а включение наночастиц PDA делало поверхность волокон шероховатой. Новая химия поверхности была подтверждена с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния (Раман) и рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (XPS). Модификация PDA улучшила гидрофильность мембран по сравнению с чистыми PCL.
Этап 2: Исследования поверхности
Учёные оценили образование слоёв костного апатита на поверхности биоматериалов, погружённых в раствор, имитирующий состав жидкостей тела (SBF). Через 7 дней на мембранах PDA/PCL наблюдались кластерные узловатые агрегаты, которые резко увеличились к 14-му дню. По мере увеличения содержания PDA количество апатита, отложившегося на поверхности, возрастало. Эти данные подтвердили повышенную in vitro биоактивность мембран PDA/PCL.
Этап 3: Биофункционализация
Учёные оценили цитосовместимость созданных мембран PDA/PCL с точки зрения адгезии, распространения и пролиферации мезенхимальных стволовых клеток человека (hMSCs). Через 6 часов культуры клетки с округлой формой плохо прилипали к чистому PCL, но образовывали филоподии для прикрепления к поверхности на трёх вариантах мембран PDA/PCL. Эксперименты по подсчёту клеток и анализу жизнеспособности CCK-8 показали, что содержание наночастиц PDA значительно влияет на количество жизнеспособных клеток на поверхности, при этом оптимальные свойства поверхности были у группы с 2% PDA/PCL.
Исследование активности щелочной фосфатазы (ALP) и продукции кальциевого матрикса с окрашиванием Alizarin Red S (ARS) показало, что рост клеток и остеогенная дифференцировка были низкими, когда количество наночастиц PDA было либо слишком высоким, либо слишком низким.
На молекулярном уровне учёные отслеживали экспрессию генов, связанных с остеогенезом (ALP, Runx2, Col1a1 и OPN) в hMSCs, культивируемых на мембранах. Через 7 дней наблюдался существенный уровень экспрессии гена ALP на образце с 2% PDA/PCL. К 14-му дню уровень экспрессии гена Runx2 в группах с 1% и 2% PDA/PCL значительно превосходил группу с чистым PCL. Наблюдения были подтверждены иммунофлуоресцентным окрашиванием, и для оптимальной индукции дифференцировки hMSCs в зрелые остеобласты были выбраны мембраны с 2% PDA/PCL.
Этап 4: Трансляционное исследование in vivo
Учёные исследовали биофункциональность микрофиброзной мембраны in vivo на модели животных. Они создали критического размера костные дефекты на черепах мышей, покрыли их волокнистыми мембранами и через 4–8 недель после имплантации провели анализ формирования кости с помощью микро-компьютерной томографии (микро-КТ), гистологического анализа и флуоресцентного мечения.
3D-изображения микро-КТ показали, что мембрана с 2% PDA/PCL обеспечила наибольшую площадь новой костной ткани с существенным расширением к центру дефекта. Учёные получили более высокое содержание кальцифицированного матрикса и ремоделирование кости в группах с 2% PDA/PCL, что свидетельствует о феноменальной остеокондуктивной интеграции.
Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) выявило фиброзную ткань в полостях группы PCL, в то время как в группе с 2% PDA/PCL была видна перестройка кости. Через 8 недель после операции в группах с 2% PDA/PCL также наблюдалась кость с обильной васкуляризацией. Дополнительное окрашивание по Массону, толуидиновым синим и иммуногистохимическое окрашивание (IHC) подтвердили формирование новой кости и коллагена. Совокупные гистологические данные показали, что использование наночастиц PDA в инженерных волокнистых мембранах значительно ускоряет регенерацию кости, подтверждая гипотезу о том, что остеодифференцировка in vitro была эффективна и in vivo.
Таким образом, команда биоинженеров создала методом со-электроспиннинга гибкие и остеопромотивные волокнистые мембраны PDA/PCL для применения в тканевой инженерии кости в регенеративной медицине. Количество наночастиц PDA в композите значительно улучшило химический состав, размер волокон и механические свойства мембран. Как эксперименты in vitro, так и данные in vivo подтвердили способность конструкций с 2% PDA/PCL к образованию новой кости по сравнению с чистым PCL. Созданные мембраны PCL/PDA остеокондуктивны, легко трансплантируются и обладают большим потенциалом для применения в направленной регенерации тканей (GTR).