Моделирование пигментного ретинита с помощью iPS-клеток
Пигментный ретинит (RP) — это группа генетически обусловленных заболеваний глаз, вызывающих такие дефекты зрения, как ночная слепота и сужение поля зрения, из-за прогрессирующей потери палочковых фоторецепторов. С заболеванием связано до 45 различных генов, что указывает на разнообразие этиологии и затрудняет разработку стандартизированной животной модели. Несмотря на ряд клинических испытаний нутритивных и лекарственных вмешательств, RP остаётся неизлечимым. Необходимы лучшие платформы для моделирования болезни и тестирования кандидатов in vitro.
Новая работа команды Цзы-Бин Дзина из Лаборатории регенерации сетчатки (Масаё Такахаси) предлагает новые инструменты для поиска методов лечения RP. В статье, опубликованной в PLoS One, сообщается о генерации индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) от пациентов с мутациями в нескольких генах, связанных с RP, и последующей дифференцировке и характеристике палочковых фоторецепторов из этих генетически различных клеток.
Получив информированное согласие от пяти пациентов с разными мутациями в генах RP1, RP9, PRPH2 или RHO, команда взяла образцы клеток кожи и использовала фибробласты для генерации iPSC. С помощью классического коктейля для репрограммирования (Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc, доставленных ретровирусным вектором) были созданы клеточные линии от каждого пациента. Их конверсия подтверждена тестами на морфологию, генетическую и кариотипическую целостность и образование тератом.
Используя эти iPSC, команда затем получила фоторецепторы с генетическими сигнатурами каждого из пяти доноров по ранее установленному поэтапному протоколу. За четыре месяца в культуре клетки прошли путь от недифференцированного состояния, подобного ES-клеткам, через стадии клеток-предшественников сетчатки и фоторецепторных прекурсоров до желаемого фенотипа палочковых фоторецепторов. Дифференцированные клетки экспрессировали маркер родопсин на высоком уровне и имели сходную электрофизиологическую функцию.
Палочковые фоторецепторы, полученные из iPSC с мутациями, связанными с RP, показали тенденцию к дегенерации, в то время как колбочковые фоторецепторы и биполярные клетки из тех же iPSC были стабильны. Механизмы этой нестабильности зависели от поражённого гена. Палочки из iPSC с мутацией в гене RP9 демонстрировали признаки окисления ДНК, а из iPSC с мутацией в гене родопсина — признаки стресса эндоплазматического ретикулума (места синтеза белка).
В качестве начального доказательства концепции для тестирования лекарств на этих RP-специфичных палочках команда изучила влияние антиоксидантных витаминов на предотвращение дегенерации in vitro. Аскорбиновая кислота, α-токоферол и β-каротин уже тестировались в клинических испытаниях как антиоксидантная терапия RP, но не показали высокой эффективности.
При обработке отдельных клеточных линий одним из трёх антиоксидантов в течение семи дней на стадии, когда происходит дегенерация палочек, было обнаружено, что α-токоферол повышал выживаемость клеток в линиях от двух пациентов с мутациями в RP9. То же лечение было неэффективно для клеток от других пациентов, а аскорбиновая кислота и β-каротин не оказали эффекта ни на одной линии.
Эти результаты, показывающие эффективность α-токоферола для повышения выживаемости палочек с мутацией RP9, подчёркивают потенциал iPSC, полученных от пациентов, для изучения механизмов болезни и тестирования методов лечения in vitro.
«Используя iPSC от пациентов с RP с разными генетическими мутациями, мы смогли показать, что полученные из этих клеток палочковые фоторецепторы подвергались апоптозу in vitro и демонстрировали различные, генетически обусловленные ответы на лечение. Это один из первых отчётов, демонстрирующих, что iPSC от пациентов могут быть полезны в персонализированной медицине, поскольку дифференциальные ответы в генетически разнородной группе обычно теряются. Будущие улучшения в протоколах дифференцировки, методах скрининга, стоимости, эффективности и разработка методов выделения фоторецепторов могут открыть новые возможности для использования этих клеток в скрининге лекарств», — говорит Масаё Такахаси.