Расширенная in situ геномная секвенирование позволяет визуализировать скрытые ДНК-белковые взаимодействия
Ученые из Гарварда представили новую методику — расширенную in situ геномную секвенирование (ExIGS). Она объединяет существующее in situ геномное секвенирование (IGS) с микроскопией расширения (ExM). Это позволило связать аномалии ядра с изменениями в регуляции генов в отдельной клетке и точно измерить ДНК-белковые взаимодействия в нанометровом масштабе.
Ограничением визуализации является дифракционный предел оптической микроскопии, который не позволяет надежно измерять взаимодействия на уровне ДНК и белков.
Микроскопия расширения решает эту проблему, физически увеличивая образец. Путем внедрения образца в набухающий полимерный гель и его расширения можно получить сверхразрешающие изображения пространственной организации клеток на обычных микроскопах.
В ExIGS микроскопия расширения интегрирована с in situ геномным секвенированием для одновременного секвенирования геномной ДНК и визуализации ядерных белков с нанометровым разрешением в отдельных клетках.
Процесс ExIGS:
- Внедрение в гель: Фиксированные клетки помещают в полиакрилатный гель, который служит каркасом для расширения.
- Химическое связывание: Геномная ДНК и белки химически сшиваются с гелем с помощью ДНК-олиго "крючков". Они связываются с ДНК-шпильками, присоединенными к геномным фрагментам и белкам, и образуют с гелем ковалентные связи.
- Расширение: Добавление воды заставляет гель равномерно набухать примерно в 4.5–5.5 раз во всех направлениях, увеличивая клетку, но сохраняя пространственные отношения между молекулами.
- Стабилизация: Для сохранения целостности расширенной структуры образец повторно внедряют во вторичный нерасширяемый акриламидный гель.
- Визуализация и секвенирование: Проводят сверхразрешающую иммунофлуоресцентную микроскопию для детальной визуализации ядерных белков. Затем методом амплификации по типу "катящегося кольца" создают клональные ДНК-ампликоны, которые секвенируют in situ.
Методика была протестирована и описана в препринте "Expansion in situ genome sequencing links nuclear abnormalities to hotspots of aberrant euchromatin repression" на сервере bioRxiv.
Ключевые результаты применения ExIGS:
- При изучении фибробластов пациента с синдромом Хатчинсона-Гилфорда (прогерия) были выявлены аномалии в ядерных ламинах. Эти белки создают "горячие точки" аномального репрессирования в активных геномных регионах, что потенциально нарушает клеточную идентичность.
- ExIGS значительно увеличивает количество геномных "прочтений" на одно ядро.
- Метод сохраняет 3D-структуру генома, сопоставимую с данными секвенирования Hi-C.
ExIGS предоставляет новую мощную платформу для изучения ДНК-белковых взаимодействий. Методика может углубить понимание широкого спектра заболеваний и генетических нарушений, раскрыть скрытые взаимодействия при клеточном старении и стать прорывной технологией в биотехнологических лабораториях.