Новая техника идентификации генов-энхансеров

Международная команда исследователей из Национальной лаборатории им. Лоуренса в Беркли разработала новый метод идентификации генов-энхансеров — последовательностей ДНК, усиливающих экспрессию конкретного гена — в геномах человека и других млекопитающих. Техника называется SIF-seq (site-specific integration fluorescence-activated cell sorting followed by sequencing). Она дополняет существующие геномные инструменты, такие как ChIP-seq (chromatin immunoprecipitation followed by sequencing), и предлагает дополнительные преимущества.

"Хотя ChIP-seq очень мощный и может за один эксперимент проанализировать весь геном на наличие характеристик, связанных с активностью энхансера, он может пропустить некоторые энхансеры и идентифицировать некоторые сайты как энхансеры, когда они таковыми не являются", — говорит Диана Дикель, генетик из Отдела геномики Berkeley Lab. "SIF-seq в настоящее время способен проверить на активность энхансера только сотни или несколько тысяч сайтов за один эксперимент, но может определить эту активность точнее, чем ChIP-seq, и поэтому является отличным валидационным анализом для оценки результатов ChIP-seq".

Потребность в новом методе

С ростом осознания важной роли генов-энхансеров в нормальном развитии клеток и заболеваниях существует большой научный интерес к их идентификации и характеристике. Это сложная задача, потому что энхансер может находиться не рядом с регулируемым геном, а за сотни тысяч пар оснований ДНК от него. Задача усложняется тем, что активность многих энхансеров ограничена специфическими тканями или типами клеток.

"Например, энхансеры мозга обычно не работают в клетках сердца, а значит, последовательность энхансера нужно тестировать в правильном типе клеток", — поясняет Дикель.

Принцип работы SIF-seq

В SIF-seq сотни или тысячи фрагментов ДНК, которые нужно проверить на активность энхансера, связывают с репортёрным геном и встраивают в единственный, воспроизводимый сайт в геномах эмбриональных клеток. Каждая эмбриональная клетка будет содержать ровно один потенциальный энхансер-репортёр. Затем с помощью флуоресцентно-активированной сортировки (FACS) идентифицируют и извлекают из смеси только те клетки, которые демонстрируют сильную экспрессию репортёрного гена — они представляют клетки с наиболее активными энхансерами.

"В отличие от предыдущих анализов энхансеров для млекопитающих, SIF-seq включает интеграцию предполагаемых энхансеров в единый геномный локус", — говорит соавтор Аксель Визель. "Таким образом, активность энхансеров оценивается в воспроизводимом хромосомном контексте, а не на основе транзиентно экспрессируемой плазмиды. Кроме того, используя эмбриональные стволовые клетки и in vitro дифференцировку, SIF-seq можно применять для оценки активности энхансера в самых разных типах клеток, релевантных для заболеваний".

Преимущества и перспективы

Метод уже показал возможность идентификации энхансеров, активных в кардиомиоцитах, нейральных клетках-предшественниках и эмбриональных стволовых клетках, и имеет потенциал для расширения на гораздо большее разнообразие типов клеток.

Способность SIF-seq использовать репортёрные анализы в мышиных эмбриональных стволовых клетках для идентификации энхансеров человеческих эмбриональных стволовых клеток, которых нет в геноме мыши, открывает интригующие исследовательские возможности.

"Гены человека и шимпанзе очень мало различаются, поэтому одна из гипотез в эволюционной геномике гласит, что фенотипические различия между ними обусловлены различиями в регуляции экспрессии генов. Провести идентификацию энхансеров с помощью ChIP-seq для изучения этой гипотезы очень сложно", — говорит Дикель. "Однако, поскольку SIF-seq требует только последовательности ДНК млекопитающего и может использоваться в различных типах клеток, должно быть возможно сравнить нейрональные энхансеры в большом геномном регионе человека с нейрональными энхансерами в ортологичном регионе шимпанзе. Это потенциально может рассказать нам интересные вещи о генетических различиях, которые дифференцируют развитие мозга человека от мозга других приматов".