Тайна 98%: Учёные стремятся пролить свет на «тёмный геном»
После завершения в 2003 году проекта «Геном человека» — секвенировавшего все 3 миллиарда «букв» (пар оснований) в человеческом геноме — многие думали, что наша ДНК станет открытой книгой. Но возникла сложная проблема: хотя учёные могли «прочитать» книгу, они могли интерпретировать лишь малую её часть.
Таинственное большинство — до 98% нашей ДНК — не кодирует белки. Многое из этой «геномной тёмной материи» считается нефункциональным эволюционным наследием. Однако среди этой некодирующей ДНК скрыты важные регуляторные элементы, контролирующие активность тысяч генов. Более того, эти элементы играют важную роль в таких заболеваниях, как рак, болезни сердца и аутизм, и могут содержать ключ к возможным методам лечения.
В рамках масштабных усилий по полному картированию и аннотации функциональных последовательностей человеческого генома, включая это «молчаливое большинство», Национальные институты здравоохранения США (NIH) 2 февраля 2017 года объявили о новом финансировании для создания пяти «центров характеризации» по всей стране, включая два в Калифорнийском университете в Сан-Франциско (UCSF). Их цель — изучить, как эти регуляторные элементы влияют на экспрессию генов и, как следствие, на поведение клеток.
Цель проекта — использовать новейшие технологии, такие как редактирование генома, для получения знаний о биологии человека, которые однажды могут привести к лечению сложных генетических заболеваний.
Важность «грамматики» генома
После того как стали очевидны недостатки проекта «Геном человека», в сентябре 2003 года Национальным исследовательским институтом генома человека (NHGRI) был запущен проект «Энциклопедия элементов ДНК» (ENCODE). Его цель — найти все функциональные области человеческого генома, независимо от того, являются они генами или нет.
«Проект "Геном человека" нанёс на карту буквы человеческого генома, но ничего не сказал нам о грамматике: где знаки препинания, где начало и конец. Именно это и пытается сделать ENCODE», — пояснила директор программы NIH Элиз Фейнголд, PhD.
Инициатива показала, что миллионы этих некодирующих последовательностей выполняют важные регуляторные действия, например, включают или выключают гены в разных типах клеток. Однако, хотя учёные установили, что эти регуляторные последовательности важны, они не знают, какую именно функцию выполняет каждая последовательность и на какой ген она влияет. Это связано с тем, что последовательности часто находятся далеко от своих генов-мишеней — в некоторых случаях на расстоянии миллионов «букв». Более того, многие последовательности по-разному действуют в разных типах клеток.
Новые гранты от NHGRI позволят пяти центрам определить функции и гены-мишени этих регуляторных последовательностей. В UCSF два центра будут базироваться в лабораториях Надава Ахитува, PhD, и Инь Шэнь, PhD. Остальные три центра будут созданы в Стэнфордском университете, Корнеллском университете и Национальной лаборатории Лоуренса в Беркли. Дополнительные центры продолжат заниматься картированием, вычислительным анализом, анализом данных и координацией данных.
Клеточные штрихкоды раскрывают регуляторную функцию
Новые технологии значительно упростили идентификацию функции и мишеней регуляторных последовательностей. Учёные могут манипулировать клетками для получения информации об их ДНК и, благодаря высокопроизводительному скринингу, делать это крупными партиями, тестируя тысячи последовательностей за один эксперимент.
«Раньше было чрезвычайно сложно тестировать функцию в некодирующей части генома, — сказал Ахитув, профессор кафедры биоинженерии и терапевтических наук. — С геном проще оценить эффект, потому что есть изменение в соответствующем белке. Но с регуляторными последовательностями вы не знаете, к чему может привести изменение в ДНК, поэтому трудно предсказать функциональный результат».
Ахитув и Шэнь используют инновационные методы для изучения энхансеров, которые играют фундаментальную роль в экспрессии генов. Каждая клетка человеческого тела содержит одну и ту же ДНК. То, станет ли клетка клеткой кожи, мозга или сердца, определяется тем, какие гены включены или выключены. Энхансеры — это скрытые переключатели, которые включают специфичные для типа клетки гены.
В предыдущей фазе ENCODE Ахитув и его коллега Джей Шендюр, PhD, из Вашингтонского университета разработали метод под названием «массовый параллельный репортерный анализ на основе лентивируса» для идентификации энхансеров. С новым грантом они будут использовать эту технологию для тестирования 100 000 регуляторных последовательностей, ранее идентифицированных ENCODE.
Их подход связывает каждую регуляторную последовательность с уникальным ДНК-штрихкодом из 15 случайно сгенерированных «букв». Между последовательностью и штрихкодом помещается репортерный ген, и вся конструкция вставляется в клетку. Если регуляторная последовательность является энхансером, репортерный ген включится и активирует штрихкод. Затем ДНК-штрихкод будет кодировать РНК в клетке.
Как только исследователи увидят, что репортерный ген включён, они могут легко секвенировать РНК в клетке, чтобы определить, какой штрихкод активирован. Затем они сопоставляют штрихкод с соответствующей регуляторной последовательностью, которая теперь известна как энхансер.
«С предыдущими методами анализа энхансеров нужно было тестировать каждую последовательность по отдельности, — объяснил Ахитув. — С нашим подходом мы можем клонировать тысячи последовательностей вместе с тысячами штрихкодов и тестировать их все одновременно».
Удаление последовательностей для понимания их роли
Шэнь, доцент кафедры неврологии и Института генетики человека, использует другой подход для характеристики функции регуляторных последовательностей. В сотрудничестве со своим бывшим наставником из Института Людвига по исследованию рака и Калифорнийского университета в Сан-Диего Бин Жэнем, PhD, она разработала метод высокопроизводительного скрининга с помощью CRISPR-Cas9 для тестирования функции некодирующих последовательностей. Теперь Шэнь и Жэнь используют этот подход, чтобы определить не только то, какие последовательности имеют регуляторные функции, но и то, на какие гены они влияют.
Шэнь будет использовать CRISPR для редактирования десятков тысяч регуляторных последовательностей в большом пуле клеток и отслеживать эффекты этих редактирований на набор из 60 пар генов, которые обычно коэкспрессируются.
Для этой работы каждая клетка будет запрограммирована отражать два флуоресцентных цвета — по одному для каждого гена — когда пара генов включена. Если свечение в клетке погаснет, учёные поймут, что её ген-мишень был затронут одним из редактирований последовательностей с помощью CRISPR. Заключительный шаг — секвенирование ДНК каждой клетки, чтобы определить, какое именно редактирование регуляторной последовательности вызвало изменение в экспрессии генов.
Наблюдая за цветами коэкспрессируемых генов, Шэнь раскроет сложные взаимосвязи между многочисленными функциональными последовательностями и множеством генов, что было невозможно с помощью традиционных методов секвенирования.
«До недавнего развития технологии CRISPR было невозможно манипулировать некодирующими последовательностями в большом масштабе, — сказала Шэнь. — Теперь CRISPR можно масштабировать, чтобы мы могли скринировать тысячи регуляторных последовательностей в одном эксперименте. Этот подход расскажет нам не только о том, какие последовательности функциональны в клетке, но и о том, какой ген они регулируют».
Может ли ДНК «тёмной материи» лечить болезни?
Каталогизируя функции тысяч регуляторных последовательностей, Шэнь и Ахитув надеются разработать правила для прогнозирования и интерпретации функций других последовательностей. Это не только поможет осветить остальную часть «тёмного генома», но и может выявить новые мишени для лечения сложных генетических заболеваний.
«Было обнаружено, что многие заболевания человека связаны с регуляторными последовательностями, — сказал Ахитув. — Например, в полногеномных исследованиях ассоциаций для распространённых заболеваний, таких как диабет, рак и аутизм, 90% вариантов ДНК, связанных с болезнью, находятся в некодирующей ДНК. Таким образом, изменён не сам ген, а то, что его регулирует».
Поскольку стоимость секвенирования генома человека значительно снизилась, ведутся разговоры об использовании прецизионной медицины для лечения многих серьёзных заболеваний. Однако остаётся препятствие — как интерпретировать мутации в некодирующей ДНК.
«Если мы сможем охарактеризовать функцию и идентифицировать гены-мишени этих регуляторных последовательностей, мы сможем начать раскрывать, как их мутации способствуют развитию заболеваний, — сказала Шэнь. — В конечном итоге мы, возможно, даже сможем лечить сложные заболевания, корректируя регуляторные мутации».