Уточнённый генный редактор, минимизирующий побочные эффекты

Инструмент CRISPR-Cas9 можно использовать для лечения наследственных заболеваний крови, но это может вызвать нежелательные генетические изменения. Команда под руководством исследователей MDC Клауса Раевски и Ван Чунг Чу представила в Science Advances подход, который минимизирует такие побочные последствия.

Терапевтический потенциал инструмента для редактирования генов CRISPR-Cas9 высок. Эти "молекулярные ножницы" можно использовать для очень точного вырезания и исправления мутаций, ответственных за наследственные заболевания. Однако, несмотря на точность, с которой инструмент находит свою цель в геноме, его работа ещё не полностью безошибочна.

Иногда разрезы делаются в участках, очень похожих на целевую последовательность, но расположенных в совершенно других областях ДНК. Эти ошибки, которые учёные называют "внецелевыми мутациями" (off-target mutations), могут иметь неожиданные последствия. И даже если CRISPR-Cas9 делает разрез в правильном месте, при восстановлении разреза могут возникать ошибки — явление, известное как "целевые мутации" (on-target mutations).

Разнесение разрезов

"Эти ошибки в основном возникают потому, что в классическом методе обе цепи молекулы ДНК разрезаются одновременно", — объясняет профессор Клаус Раевски. Вместе с другими исследователями из MDC и Университета Гумбольдта в Берлине учёный представил в журнале Science Advances новый, усовершенствованный подход, названный "spacer-nick". Этот метод использует модифицированную пару молекулярных ножниц, известных как никаза, которые делают надрезы на противоположных цепях ДНК в двух разных точках.

Но более высокая точность, с которой этот дуэт для редактирования генов способен обнаруживать и исправлять дефектные гены, во многом обусловлена спейсером, встроенным командой в инструмент. "Мы используем этот спейсер, чтобы гарантировать, что два надреза делаются на расстоянии 200–350 пар оснований друг от друга и избежать разрывов обеих цепей ДНК", — объясняет доктор Ван Чунг Чу. "Наши эксперименты с гемопоэтическими стволовыми клетками и T-клетками показали, что это оптимальное расстояние для минимизации как целевых, так и внецелевых мутаций", — говорит Чу. "Если расстояние меньше, мы рискуем разрезать всю молекулу ДНК — несмотря на использование двух отдельных ножниц".

Эффективный и почти безошибочный

Учёные могут даже количественно оценить превосходство своих уточнённых генетических ножниц по сравнению с двойными разрезами: "При использовании классического метода CRISPR-Cas9 целевые мутации возникают более чем в 40% случаев вмешательства", — сообщает Чу. "Система spacer-nick может снизить этот показатель до менее 2%". Что касается внецелевых мутаций, Чу объясняет, что их успех нельзя определить так же легко и точно: "Всё, что мы можем сказать, это то, что они возникают относительно часто при использовании классических генетических ножниц, но были редким, если не несуществующим, явлением в нашем подходе". Пока остаётся неясным точный механизм восстановления генетического материала после разрезов spacer-nick. "Похоже, это происходит не через известный — и подверженный ошибкам — путь NHEJ", — говорит Чу.

По эффективности spacer-nick не уступает традиционному инструменту: "С помощью обоих методов мы можем успешно восстановить от 20 до 50% обработанных клеток", — говорит Чу. Этого, вероятно, достаточно, чтобы вылечить пациентов с наследственным заболеванием крови, вызванным изменением только одного гена. Примерами таких заболеваний являются бета-талассемия, связанная с нарушением синтеза красного кровяного пигмента гемоглобина, или тяжёлая врождённая нейтропения, характеризующаяся значительным снижением количества гранулоцитов (типа белых кровяных клеток) и связанная с сильно ослабленной иммунной защитой.

Исправление стволовых клеток

Чу и Раевски надеются, что другие исследователи воспримут их идею и протестируют spacer-nick — сначала на животных моделях, а затем и на первых пациентах. Принцип терапии прост: у людей с моногенным наследственным заболеванием с помощью установленных методов берут кроветворные стволовые клетки. Spacer-nick затем исправляет дефектные гены непосредственно в клеточной культуре. После того как генетические ножницы выполнят свою работу, исправленные стволовые клетки вводятся обратно пациенту, где они производят новые и, что самое важное, здоровые клетки крови.