Новые методы повышения эффективности генной инженерии у мышей и крыс

Исследователи под руководством Томодзи Машимо (Университет Осаки) и Кадзуто Ёситоми (Национальный институт генетики, Япония) разработали два новых метода генной модификации: lsODN (long single-stranded oligodeoxynucleotide) и 2H2OP (two-hit two-oligo with plasmid). Оба метода основаны на использовании систем CRISPR-Cas и ssODN (single-stranded oligodeoxynucleotide).

Системы CRISPR-Cas упростили редактирование генов у мышей и крыс. Введение мРНК Cas9 и гидовой РНК (gRNA) приводит к разрезанию целевой ДНК ферментом Cas9. Разрыв ДНК восстанавливается путём негомологичного соединения концов, что вызывает мутации и «выключение» гена (knock-out).

Если же вместе с Cas9-gRNA ввести ssODN, то разрыв ДНК восстанавливается через гомологичную рекомбинацию с использованием матрицы-донора. Это позволяет вставить последовательности длиной от одного до нескольких десятков пар оснований (bp). Однако синтез олигонуклеотидов ssODN ограничен длиной ~200 bp, что затрудняло вставку крупных последовательностей, например, гена GFP (зелёный флуоресцентный белок).

С помощью новых методов lsODN и 2H2OP учёным удалось:

• Эффективно и точно вставить гены GFP.
• Ввести крупные геномные области размером ~200 тыс. пар оснований (kbp), что ранее было невозможно.
• Заменить гены крыс на человеческие, создав гуманизированных животных.

Эти методы повысят эффективность генной инженерии не только у мышей и крыс, но и у других организмов. Они станут полезными инструментами для создания новых генетически модифицированных моделей, которые найдут применение в разработке лекарств, трансляционных исследованиях и регенеративной медицине.