Новый метод выводит анализ генетических библиотек на новый уровень

Исследователи из Уппсалы разработали новый метод для изучения динамических процессов в больших генетических библиотеках. Применяя этот метод к исследованию регуляции клеточного цикла, учёные могут получить более чёткую картину неуловимого механизма контроля. Исследование опубликовано в журнале Nature Methods.

Современные генные технологии позволяют быстро и недорого вносить тысячи модификаций ДНК в клетки человека или бактерий, создавая генетические библиотеки. Система CRISPR/Cas9, или «генетические ножницы», может быть модифицирована для изменения экспрессии тысяч белков. Помечая каждую модификацию генетическим штрих-кодом, можно отслеживать, какая клетка несёт какое изменение.

Современные достижения в оптике и анализе изображений позволяют исследовать химические процессы внутри клетки с чрезвычайно высокой точностью. В принципе, можно наблюдать базовые биологические процессы, такие как экспрессия белка или деление клетки, на молекулярном уровне внутри живой клетки.

Сочетание этих продвинутых оптических методов с масштабным генетическим инжинирингом крайне желательно. Исследователи могли бы, в теории, идентифицировать все гены, вовлечённые в определённый процесс, наблюдая за биологией в генетической библиотеке. Исследования, которые ранее занимали несколько лет, теоретически можно провести в одном эксперименте.

Технические сложности ранее мешали учёным реализовать эту теорию на практике. Как отслеживать тысячи клеток, чтобы сначала изучить их биологию, а затем прочитать генетический штрих-код?

Группа исследователей из Уппсалы приняла вызов и представляет метод DuMPLING (Dynamic u-fluidic Microscopy-based Phenotyping of a Library before IN situ Genotyping). Этот метод позволяет исследовать целую библиотеку живых клеток в одном микрофлюидном чипе.

«Метод исключительно мощный и позволяет нам связать генетическую информацию со сложным поведением клеток на совершенно новом уровне», — говорит Йохан Эльф, профессор физической биологии, руководивший исследованием.

Среди прочего, Эльф и его команда изучают бактериальный клеточный цикл. Во всех клетках критически важно, чтобы вся ДНК была скопирована ровно один раз перед каждым делением клетки. Если это не так, клетка рискует потерять генетический материал или накопить ДНК с одинаково разрушительными последствиями. Хотя регуляция клеточного цикла изучается десятилетиями, до сих пор неясно, как клетки достигают необходимого строгого контроля.

«Мы можем разрабатывать модели, воспроизводящие механизм, но поскольку мы ещё не знаем всех участников, трудно проверить, насколько модели биологически релевантны. Этот новый метод позволит идентифицировать неизвестные компоненты», — говорит Даниэль Камсунд, исследователь молекулярной клеточной биологии Уппсальского университета.

Исследователи создали генетическую библиотеку, в которой снизили экспрессию различных известных регуляторов клеточного цикла, а также некоторых неизвестных генов, а затем использовали метод DuMPLING, чтобы изучить, как эти модификации повлияли на клеточный цикл. Следующий шаг — ключевое изменение. Когда все данные о клеточном цикле собраны, питательный раствор в чипе заменяют на раствор, который сохраняет клетки и фиксирует их в позициях. Генетический штрих-код теперь можно считать с помощью микроскопии и цветных фрагментов ДНК.

«Завораживает видеть, как развивается цветовой код, но, к счастью, мы не расшифровываем его вручную. У нас есть программное обеспечение для идентификации», — говорит Джимми Ларссон, исследователь молекулярной клеточной биологии Уппсальского университета.

Результаты обнадёживают. Из данных исследователи могут идентифицировать большинство известных регуляторных элементов, что означает работоспособность метода. Поскольку DuMPLING даёт данные с временным разрешением, также можно определить, как различные модификации влияют на клеточный цикл. На следующем этапе команда планирует расширить библиотеку, включив в неё все гены бактериального генома. Это, надеются учёные, приблизит исследование к полному описанию механизма контроля клеточного цикла.