Новый метод создания штаммов дрожжей Pichia pastoris с высокой продуктивностью полезных белков
Международная группа исследователей успешно идентифицировала и инактивировала гены в дрожжах Pichia pastoris для увеличения секреторного производства полезных белков. Комбинируя множественные инактивации генов и проводя последовательное культивирование полученных штаммов, учёные разработали штаммы P. pastoris, способные производить полезные белки с высоким выходом. Это открытие может привести к развитию технологий улучшения производства белков для биомедицинских антител и промышленных ферментов.
Результаты опубликованы в журнале Communications Biology 8 июня 2022 года.
Основные положения
- Для идентификации инактиваций генов P. pastoris, повышающих секрецию полезных белков, использован высокопроизводительный мультилуночный анализ.
- Секреторное производство полезных белков увеличивалось при комбинации множественных инактиваций идентифицированных генов.
- Эти множественные инактивации генов повышали секреторное производство даже при использовании разных полезных белков или промоторов для их экспрессии.
- Последовательное культивирование штаммов с множественными инактивациями генов (штаммов-продуцентов) дополнительно увеличивало секрецию полезных белков.
Методология исследования
Исследователи разработали трёхэтапный подход для повышения продуктивности трудносекретируемых белков в P. pastoris:
- Создание библиотеки случайных инактиваций генома и скрининг. Была разработана простая система высокопроизводительного скрининга для оценки секреции модельного белка — одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv) антитела против лизоцима. Скрининг более 19 000 мутантных штаммов позволил идентифицировать шесть генов, инактивация которых увеличивает продукцию scFv (пять из них — новые). Попутно была обнаружена точечная мутация (V50A) в сигнальной последовательности MFα, также значительно усиливающая секрецию.
- Комбинирование множественных инактиваций. Накопление инактиваций идентифицированных генов в штамме-продуценте scFv приводило к повышению продуктивности. Штамм с инактивацией четырёх генов показал пятикратное увеличение продуктивности по сравнению с исходным штаммом. Эффект был воспроизведён не только для scFv, но и для штамма, продуцирующего β-глюкозидазу, а также для scFv-штамма с другим промотором.
- Последовательное культивирование (Adaptive Laboratory Evolution, ALE). Поскольку накопление инактиваций генов снижало скорость роста клеток, было проведено более 50 циклов последовательного культивирования в свежей питательной среде. Это позволило восстановить скорость роста у большинства штаммов и дополнительно повысить их продуктивность по scFv.
Значение и перспективы
Представленный метод (скрининг → комбинирование инактиваций → адаптивная эволюция) служит основой для разработки новых штаммов-хозяев P. pastoris с повышенной продуктивностью полезных белков. В дальнейшем исследователи планируют использовать полученные данные для создания штаммов с ещё более высокой продуктивностью трудноэкспрессируемых целевых белков.