Новый метод CRISPR выявил ключевые гены для выживания токсоплазмы

Используя новый подход к генетическому скринингу с CRISPR, исследователи из Института Фрэнсиса Крика определили ключевые гены для выживания паразита Toxoplasma gondii в мышах.

Их новый метод, опубликованный в Nature Communications, предлагает гибкий подход, который может расширить использование CRISPR-скрининга. Метод также позволяет одновременно тестировать сотни генов паразита на мышах, существенно сокращая количество используемых лабораторных животных.

Универсальное создание библиотек для CRISPR-скрининга

CRISPR-скрининг — мощный способ определения функции генов. С помощью направляющих РНК (gRNA) специфические гены выключаются ("нокаутируются"). Это помогает определить, какие гены необходимы для выживания клетки. Однако такие скрининги часто проводятся в масштабе всего генома, что может ограничивать типы возможных экспериментов.

Чтобы преодолеть эти ограничения, команда разработала метод быстрого создания и анализа пользовательских CRISPR-библиотек различного размера и состава с использованием одноэтапного клонирования. Исследованием руководила лаборатория сигнализации в апекомплексных паразитах совместно с сотрудниками отделений биоинформатики и высокопроизводительного скрининга.

"Этот метод создания и анализа пулов gRNA, нацеленных только на подмножество генов, позволил нам проводить CRISPR-скрининги гораздо быстрее и перенести их в модель инфекции in vivo", — говорит Мориц Трек, старший автор статьи.

"gRNA, нацеленные на гены-мишени, отбираются из массива, клонируются и собираются в объединённые CRISPR-библиотеки. Эта пользовательская библиотека затем вводится в паразита для создания пула мутантов, который выращивается на мышах или в клеточной культуре. Секвенируя исходный и конечный пулы мутантов, мы можем идентифицировать гены, важные для роста в любых условиях отбора".

Новые гены

Toxoplasma gondii — паразит, которым заражена примерно треть населения Земли. У здоровых людей инфекция часто протекает бессимптомно, но паразит представляет серьёзную угрозу для пациентов со СПИДом, развития плода в утробе матери, а вирулентные штаммы, вызывающие глазные заболевания, распространены в Южной Америке. Ранее полногеномный генетический скрининг in vitro использовался для выявления генов, необходимых для роста в клеточной культуре, но методы скрининга для идентификации генов, важных для регуляции иммунного ответа хозяина и обеспечения выживания in vivo (так называемых "факторов вирулентности"), были недоступны.

"Выбирая подмножество генов для воздействия, мы не рисковали перегрузить хозяина до того, как паразит сможет размножиться", — говорит Джоанна Янг, соавтор статьи. — "Мы заразили мышей пулами мутантов токсоплазмы, которые, как мы предполагали, играют роль во взаимодействии с хозяином. Это выявило новые факторы вирулентности, а также подтвердило уже известные".

Интересно, что команда также обнаружила, что некоторые штаммы, неспособные выжить самостоятельно, были успешны при совместном заражении в смешанном пуле.

"Например, ген MYR1 необходим для функционирования многих секретируемых белков Toxoplasma, и без него паразит не может вызвать инфекцию", — объясняет Джоанна. — "Но мы с удивлением обнаружили, что нокауты MYR1 всё ещё присутствовали и могли выжить в мышах при совместном заражении с другими мутантами. Теперь нам нужно выяснить, как это происходит!"

Следующие шаги

Следующий этап уже начался. Команда будет сотрудничать с отделением передового секвенирования, чтобы идентифицировать отдельные CRISPR-мутанты и полную РНК инфицированной клетки хозяина для выявления факторов вирулентности, которые специфически влияют на ответ хозяина.