Выключатель CRISPR в «ошибочной» фазе клеточного цикла может решить проблему нецелевого редактирования

Исследователи из Университета Хиросимы и Токийского медицинского и стоматологического университета разработали метод, позволяющий повысить точность CRISPR-Cas9. Он предполагает отключение редактирования генов до тех пор, пока клетка не достигнет ключевых фаз цикла, где более вероятен точный ремонт ДНК.

Результаты исследования, опубликованные в Communications Biology, показали более точное редактирование и подавление нежелательных делеций, вставок или мутаций — так называемых нецелевых эффектов (off-target effects). Предыдущие методы, снижавшие эти эффекты, часто имели низкую эффективность редактирования.

Больше контроля над редактированием

Новый метод использует анти-CRISPR белок AcrIIA4, который работает как «выключатель», останавливающий активность редактора SpyCas9. Исследователи сшили AcrIIA4 с N-концевым участком человеческого белка Cdt1 (регулирующего репликацию ДНК), чтобы деактивировать редактирование до фаз S и G2 клеточного цикла. В этих фазах доминирует гомологичная рекомбинация (HDR) — предпочтительный механизм репарации, использующий вторую копию хромосомы как шаблон для точного восстановления разрыва.

Другой механизм, негомологичное соединение концов (NHEJ), работает во всех фазах цикла (особенно в G1) и часто приводит к ошибкам, просто соединяя концы разорванной ДНК.

Ключевые результаты

• Количество белка AcrIIA4-Cdt1 зависит от клеточного цикла: оно высоко в фазе G1 (что блокирует редактирование и NHEJ) и снижается в фазах S, G2 и M.
• Эффективность HDR при использовании AcrIIA4-Cdt1 увеличилась примерно в 4,0 раза по сравнению с использованием одного SpyCas9.
• Коэффициент мутаций в целевом сайте (или в одном из нецелевых — гене HCN1) снизился на 86,5%.
• В другом нецелевом сайте (ген MFAP1) коэффициент мутаций упал с 8,5% до 0,6%.

Сочетание SpyCas9 и AcrIIA4-Cdt1 создает систему активации Cas9, зависимую от клеточного цикла, для точного и эффективного редактирования генома.

Исследователи планируют улучшить систему для безопасного терапевтического применения, а также адаптировать её для других CRISPR/анти-CRISPR комбинаций, базовых редакторов и систем направленной регуляции транскрипции.