Ремонт ДНК после разрезания CRISPR оказался не таким, как думали

Несмотря на большие надежды и инвестиции в редактирование генов CRISPR-Cas9, ученым еще многое предстоит узнать о том, как оно работает в клетках человека.

Ученые из Калифорнийского университета в Беркли обнаружили, что общепринятые представления о том, как клетки восстанавливают геном после разрезания ДНК ферментом Cas9, ошибочны.

Это открытие дает понимание, почему редактирование CRISPR-Cas9 работает замечательно хорошо почти в каждой клетке, хотя и с разной эффективностью. Оно может помочь исследователям повысить эффективность вставки новой ДНК в геном — например, для замены вредной мутации на правильную последовательность — и в целом настроить процесс редактирования для получения желаемого результата.

"Редактирование генов — невероятно мощный инструмент, но пока что во многом основан на методе проб и ошибок. То, как он работает в человеческих клетках, было "черным ящиком" с множеством предположений", — говорит ведущий автор Джейкоб Корн.

Результаты исследования опубликованы в августовском номере журнала Nature Genetics.

CRISPR полагается на ремонт ДНК

Точность CRISPR-Cas9 заключается в его способности находить конкретную последовательность ДНК в геноме и разрезать двуцепочечную молекулу. Однако после этого восстановление повреждения зависит от клетки.

Восстановление может идти двумя путями:

  1. Негомологичное соединение концов (NHEJ): ферменты "сшивают" свободные концы, что часто приводит к вставке или удалению нуклеотидов и нарушению функции гена. Это, по-видимому, наиболее частый исход.
  2. Ремонт с направлением по гомологии (HDR): другие ферменты "латают" разрыв с помощью одноцепочечной ДНК, соответствующей последовательностям вокруг разреза. Это происходит чаще в одних типах клеток, чем в других, и требует наличия "заплатки" ДНК.

Чтобы выяснить, какие ферменты репарации ДНК критически важны для HDR после разреза CRISPR, исследователи использовали метод CRISPR-интерференции (CRISPRi), чтобы по очереди "выключить" более 2000 генов, связанных с репарацией ДНК.

Неожиданно оказалось, что многие важные для HDR гены входят в путь анемии Фанкони — систему из 21 белка, которая, как ранее считалось, не участвует в репарации после CRISPR.

Путь анемии Фанкони

Этот путь был известен десятилетиями, но в основном его связывали с репарацией одного специфического повреждения — межцепочечных сшивок ДНК.

"Основываясь на нашей работе, мы полагаем, что путь анемии Фанкони играет главную роль в исправлении и других типов повреждений, в частности, двуцепочечных разрывов", — отмечает Крис Ричардсон, первый автор статьи. "После редактирования Cas9 путь Фанкони необходим, если вы хотите вставить новую ДНК".

Это ставит под сомнение некоторые планируемые CRISPR-терапии самой анемии Фанкони, так как без активного пути клетки могут быть неспособны заменить мутировавшие гены.

Исследователи пришли к выводу, что NHEJ является механизмом репарации по умолчанию, но путь Фанкони конкурирует с ним. Более высокая активность этого пути приводит к большему количеству HDR и меньшему — NHEJ.

Значение для лечения рака

Открытие расширяет список белков, которые могут быть мишенями для противораковой терапии. Нарушая репарацию ДНК в раковых клетках, можно сделать их более уязвимыми.

Также было обнаружено, что один из белков пути, FANCD2, всегда накапливается в сайте двуцепочечного разрыва, созданного CRISPR-Cas9. Это указывает на его важную роль в регуляции вставки новой ДНК. FANCD2 можно использовать для:

  • Повышения частоты HDR.
  • Картирования мест разреза Cas9 в любом типе клеток (по локализации FANCD2 в геноме).

"Весь путь анемии Фанкони влияет на баланс между NHEJ и HDR; он действует как регулировщик. Таким образом, генотип пациента будет влиять на стратегию редактирования генов", — резюмирует Джейкоб Корн.