CRISPR-Cas9 эффективнее "ломает" гены, если нарушить репарацию ДНК

Исследователи из Калифорнийского университета в Беркли нашли способ повысить эффективность "выключения" (нокаута) генов с помощью CRISPR-Cas9 в 2,5–5 раз для большинства типов человеческих клеток. Это упрощает создание нокаутных клеточных линий для исследований и потенциально может быть использовано для терапии генетических заболеваний.

Ключевым оказалось введение в клетку вместе с белком CRISPR-Cas9 коротких синтетических олигонуклеотидов, которые не имеют гомологии ни с одной последовательностью в геноме человека. Эти олигонуклеотиды, по-видимому, мешают механизмам репарации ДНК в клетке, что значительно повышает эффективность редактирования даже для изначально малоэффективных систем CRISPR-Cas9.

"Оказывается, если сделать нечто очень простое — просто добавить клеткам недорогие синтетические олигонуклеотиды, не имеющие гомологии в человеческом геноме, — частота редактирования возрастает впятеро", — сказал ведущий исследователь Джейкоб Корн.

Повышенная эффективность критически важна для создания нокаутных клеточных линий, особенно из раковых клеток (таких как HeLa), которые часто имеют более двух копий каждого гена. Высокая эффективность также необходима для потенциальной терапии наследственных мутаций у человека.

Репарация ДНК — ключ к успеху CRISPR-Cas9

CRISPR-Cas9 работает, разрезая ДНК в заданном месте. Клетка пытается восстановить разрыв, но при репарации может допустить ошибку, которая инактивирует ген. Эффективность этого процесса зависит от конкретной направляющей РНК (guide RNA) и типа клетки.

Корн предположил, что низкая эффективность разрезания Cas9 в некоторых случаях связана с механизмами репарации ДНК. Случайные нити ДНК (негомологичные) могут "сбить с толку" процесс репарации и повысить частоту успешного нокаута гена.

"Это дает клетке небольшой толчок, чтобы предотвратить нормальный ремонт", — объяснил он.

Он описывает редактирование генов как соревнование между разрезанием и репарацией ДНК. Возможно, олигонуклеотиды снижают точность репарации или заставляют клетку переключиться на более подверженный ошибкам механизм восстановления, что позволяет Cas9 легче "сломать" ген.

Следующий рубеж — использование особенностей репарации ДНК для улучшения вставки последовательностей, чтобы заменить дефектный ген нормальным и потенциально вылечить генетическое заболевание.

Результаты исследования опубликованы 17 августа в онлайн-журнале Nature Communications.