Открытие правил для CRISPR продвигает метаболическую инженерию
Исследователи из Политехнического института Ренсселера (RPI) открыли правила, управляющие вариантом метода генного редактирования CRISPR/Cas9, что позволяет использовать живые клетки для производства ценных метаболических соединений, таких как фармацевтические препараты и нутрицевтики. Они разработали новые инструменты для контроля сигнальных путей в клетках, чтобы производить нужные соединения, снижать выработку нежелательных и увеличивать производство ценных.
Исследование, опубликованное в Nucleic Acids Research, описывает аспект метода CRISPR/Cas9, использующий деактивированный белок dCas9. В частности, учёные показали, как варьировать короткий фрагмент РНК (гид РНК) для создания множества инструментов на основе dCas9, каждый из которых может блокировать активность в одной точке сложных многоступенчатых сигнальных путей без перекрёстных помех (кросс-тока).
"CRISPR — одна из самых мощных технологий редактирования генов, но до сих пор мы видели её применение только в здравоохранении. Это первое реальное применение в метаболической инженерии для создания высокоценных продуктов с помощью этого подхода", — сказал руководитель исследования Маттеос Коффас.
Система CRISPR/Cas9 основана на естественной защите бактерий от вирусов. Гид РНК, комплементарная вирусной ДНК, направляет комплекс Cas9 к цели для её разрезания. В метаболической инженерии используется вариант CRISPR/dCas9, где деактивированный белок dCas9 не режет ДНК, а блокирует транскрипцию, связываясь с целевым участком (промотором) и оставаясь на месте. Это позволяет контролировать производство соединений клеткой, перенаправляя её ресурсы.
Однако для полного раскрытия потенциала метода необходимо было лучше понять риск кросс-тока — когда гид РНК, предназначенный для одного промотора, ошибочно связывается с другим промотором схожей последовательности.
ДНК состоит из четырёх нуклеотидов (C, G, A, T), которые комплементарны нуклеотидам РНК. Для связывания гид РНК и целевой ДНК их последовательности должны быть комплементарны, но полное совпадение не всегда обязательно. Правила, определяющие, сколько несовпадений (мисматчей) допустимо, были неясны.
Брэди Кресс, первый автор исследования, изучил 20-нуклеотидный промотор, систематически изменяя до трёх последовательных пар оснований в определённом участке. Он обнаружил, что в трёхнуклеотидной последовательности система будет связываться при одном несовпадении, но не будет — при двух или трёх.
"Это важное открытие, потому что оно позволяет создавать инструменты для независимого контроля разных генов одновременно без какого-либо кросс-тока", — сказал соавтор Роберт Линхардт. "Теперь мы можем создать значительное количество инструментов — десятки — на основе одного промотора, которые можно контролировать независимо".
В качестве доказательства концепции Кресс встроил промоторы, соответствующие новому правилу, в модельный путь в клетках Escherichia coli. В зависимости от активируемых участков пути клетки производили соединения предсказанных цветов: бесцветные, фиолетовые или зелёные.
Исследование "Rapid generation of CRISPR/dCas9-regulated, orthogonally repressible hybrid T7-lac promoters for modular, tuneable control of metabolic pathway fluxes in Escherichia coli" опубликовано 12 апреля 2016 года в Nucleic Acids Research.