CRISPR PRO-LiveFISH: новая технология для визуализации генома в живых клетках
Существующие методы визуализации на основе CRISPR-Cas, способные нацеливаться на эндогенные геномные последовательности, имеют ограничения из-за сложности системы и чувствительности, особенно при визуализации нерепетитивных локусов, многоточечной визуализации или работе с первичными клетками.
Для решения этих проблем совместная исследовательская группа из Института биофизики Китайской академии наук и Университета Цинхуа разработала новую технологию визуализации ДНК в живых клетках — CRISPR PRO-LiveFISH (Pooled gRNAs with Orthogonal bases LiveFISH). Эта технология интегрирует CRISPR с технологией расширенного генетического алфавита.
На основе предыдущего подхода CRISPR LiveFISH обновлённая система впервые вводит ортогональные неестественные пары оснований из расширенного генетического алфавита для сайт-специфичной флуоресцентной метки однонаправляющих РНК (sgRNA). Благодаря рациональному дизайну структур Cas9-sgRNA исследователи достигли значительного улучшения чувствительности мечения проб.
Исследование было опубликовано в Nature Biotechnology 6 ноября.
Метод PRO-LiveFISH интегрирует конструирование библиотек ДНК с технологией расширенного генетического кода, чтобы объединить стратегии транскрипции in vitro и посттранскрипционной модификации. Это позволяет генерировать высокопроизводительную, сайт-специфичную, эффективно меченую библиотеку проб sgRNA. Технология обеспечивает высокочувствительную визуализацию нерепетитивных последовательностей ДНК в живых клетках, включая первичные клетки. Метод упрощает экспериментальные процедуры и минимизирует потенциальное вмешательство в нативную структуру и функцию генома.
С помощью PRO-LiveFISH исследователи достигли одновременного отслеживания в реальном времени нескольких геномных локусов внутри живых клеток. Они систематически раскрыли взаимосвязь между динамикой хроматина и эпигенетическими состояниями, выяснили пространственно-временные характеристики взаимодействий энхансер-промотор (E-P) и показали критическую роль транскрипционного коактиватора BRD4 в поддержании трёхмерных (3D) взаимодействий суперэнхансеров. Эти результаты углубляют понимание эпигенетической регуляции и пространственно-временной динамики 3D-генома.
Благодаря высокой чувствительности, специфичности и совместимости с различными типами клеток, CRISPR PRO-LiveFISH открывает новые пути для изучения того, как организация 3D-генома и эпигенетические модификации координируются для контроля экспрессии генов, клеточной идентичности и болезненных процессов, таких как рак.