Улучшенные CRISPR-ферменты повышают перспективность вставки целых генов в геном

Многие генетические заболевания вызваны разнообразными мутациями, распределёнными по всему гену. Создание подходов к редактированию генома для каждой конкретной мутации пациента было бы непрактичным и дорогостоящим.

Исследователи из Массачусетской больницы общего профиля (MGH) разработали оптимизированный метод, повышающий точность вставки крупных сегментов ДНК в геном.

Этот подход можно использовать для вставки целого нормального или «дикого типа» замещающего гена, что может стать универсальной терапией заболевания независимо от конкретной мутации пациента.

Работа включает оптимизацию нового класса технологий — CRISPR-ассоциированных транспозаз (CAST). Эти перспективные инструменты для крупных вставок ДНК можно легко направить на нужный участок генома с помощью перепрограммируемой направляющей РНК.

Однако в естественном состоянии CAST обладают нежелательными для редактирования генома свойствами: субоптимальной чистотой продукта (частота вставки только целевой последовательности ДНК) и относительно высоким уровнем нецелевой интеграции в непредусмотренные участки генома.

В исследовании, опубликованном в Nature Biotechnology, команда под руководством первого автора Коннора Ту (аспирант MIT и MGH) и старшего автора Бена Кляйнстивера (доктор философии, MGH, доцент Гарвардской медицинской школы), устранила эти недостатки, используя методы белковой инженерии для изменения свойств систем CAST.

Они обнаружили, что добавление определённого фермента — никирующей эндонуклеазы-интрона (nicking homing endonuclease) — к CAST приводит к резкому увеличению чистоты продукта в сторону целевой вставки.

Дальнейшая оптимизация структуры CAST привела к вставкам ДНК с высокой эффективностью интеграции в целевые участки генома и значительным снижением вставок в нежелательные нецелевые сайты.

Исследователи назвали новую улучшенную систему «HELIX» (Homing Endonuclease-assisted Large-sequence Integrating CAST-compleX).

«Мы продемонстрировали универсальный подход, который можно использовать для модификации различных систем CAST в более безопасные и эффективные версии с высокой чистотой продукта и специфичностью в масштабе всего генома», — говорит Коннор Ту.

«Объединив наши данные, мы создали системы HELIX со специфичностью интеграции по целевому сайту более 96% — по сравнению с примерно 50% у естественной системы CAST дикого типа. Мы также установили, что HELIX сохраняет свои преимущественные свойства в клетках человека», — продолжает Ту.

Кляйнстивер отмечает, что технология может иметь применение не только для восстановления нормальных здоровых генов у людей с болезнетворными мутациями.

«Кроме того, программируемая интеграция ДНК может способствовать клеточной инженерии, когда установка крупных генетических последовательностей в целевые локусы может наделить клетки новыми свойствами, избегая проблем с безопасностью, эффективностью и производством, возникающих при традиционных подходах со случайной интеграцией», — говорит он.

Соавтором исследования также является Бенно Орр.